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miércoles, 8 de septiembre de 2010

CONCLUSIONES Y DISCUSIÓN:

Tema 1: Estructura y composición del ADN, los genes y los cromosomas:

CONCLUSIONES: Primero es de aclararse la cadena o secuencia de ADN-genes-cromosomas: un cromosoma està compuesto por genes que son cadenas determinadas de ADN. Por lo que un cromosoma tiene una informaciòn variada que determina diferentes caracterìsticas genotìpicas y fenotìpicas de un individuo. Los genes se limitan a determinadas caracterìsticas o funciones, por lo que sus secuencias de ADN son diferentes y al mismo tiempo relacionadas con la informaciòn contenida en cada gen.

Por esto, lo que hay que analizar es la composiciòn y estructura del ADN. En primer lugar, podemos establecer que su estructura de doble hèlice en forma de espiral, y en direcciòn antiparalela 3`-5`y 5'.3', determina muchos factores: comenzando con la acciòn de enzimas que corten el ADN para sacar muestras y amplificarlas, transcripciòn, la acciòn de las histonas, etc...Su estructura es muy importante  y versàtil para su funciòn.

Es tambièn muy importante recalcar que, en el ADN, lo único que está variando es la base nitrogenada y su complemento, pues lo que es el grupo fosfato y la desoxirribosa siempre seràn iguales en toda la cadena. Por lo que determina las diferencias en la informaciòn genètica son las secuencias dterminadas de bases nitrogenadas.

Pasando a los genes, la importancia reside en las determinadas secuencias allí halladas, pues están directamente relacionadas con la funciòn o característica de la cual está encargado cada gen. Dependiendo de las secuencias de bases nitrogenadas, se hallan los diferentes genes y las diferencias entre estos mismos y sus funciones o características a desarrollar.

Y a nivel de cromosomas, es recalcable su estructura, ya que las anormalidades o mutaciones en esta determinan la salud y condiciones de los nuevos individuos. Los cromosomas con estructura anormal generan anormalidades que varìan en complejidad (algunas son incluso anormales) en los nuevos individuos. Todos los cromosomas de un ser humano son diferentes en forma. De mayor a menor y por la posición del centrómero se organizan en un cariotipo.

DISCUSIÓN: Me parece que la estructura y la composición del ADN son vitalmente versátiles y funcionales,  teniendo en cuenta su accionar, sus funciones, su organización,etc...Ambas permitren la infinidad de funciones que el ADN lleva a cabo y lo que, con ellas, permite(como la modificación genética, clonaciones, tratamiento de enfermedades y malformaciones, fabricación de proteínas y aminoácidos, etc...).

Por un lado, la estructura es más simple. Pero ésto no conlleva a que sus implicaciones sean igual de simples (como su organización en las histonas, la duplicación, etc...). Por otro lado, la composición consta de compuestos químicos complicados, uniones por puentes de hidrógeno y, en general, reacciones químicas complejas, acciones de enzimas, etc...

A nivel general, el ADN, genes y cromosomas tienen grandes determinaciones, y de ellos dependen todo lo relacionado con el desarrollo de nuevos individuos. Su inmensa versatilidad permite infinidad de funciones y por esto, la diversidad de organismos e individuos. Con el avance de la tecnología y la ciencia, se está conociendo más a fondo todo acerca del ADN, y sus aplicaciones varían tanto como la misma variabilidad del ADN  lo permite. Se tratan enfermedades, se clonan organismos, se fabrican ciertos productos industriales, se producen ciertas proteínas, etc...

Tema 2: Generalidades de cariotipos:

CONCLUSIÓN: Un cariotipo es un mapeo de los cromosomas (información genétia de un individuo) de cualquier célula de un individuo. Además organiza los cromosomas por su tamaño y la posición del centromero.

Los cariotipos han cobrado un gran importancia en la actualidad, pues pueden prececir enfermedades prenatales, malformaciones, mutaciones y enfermedades congènicas. De la mano de la modificaciòn genètica y toda la industria de la ingeniería genética están tratando de prever y corregir malformaciones y enfermedades congénicas, curar enfermedades ya después del nacimiento que hasta hace muy poco eran totalmente incurables.

Otro aspecto resaltable es la multiplicidad de formas de extraerle la información genética a un individuo:cualquier cèlula o tejido lo permite. Lo único que varía es la tecnología necesaria para procesar los distintos tipos de muestras, la practicidad para obtenerlas y procesarlas y la facilidad para analizarlas.

DISCUSIÓN: Me parece un gran avance de la tecnología, con gran utilidad tanto social como científica. Recordemos que permite predecir malformaciones o normalida, mutacioes, enfermedades hereditarias, congénicas, etc...

En lo social trae implicaciones de carácter psicológico, en base de predicción de normalidad o malformaciones congénicas. Así, se puede preparar psicológica, mental y técnicamente a los padres de bebes con síndromes, enfermedades y malformaciones.

En lo científico se dan implicaciones meramente d conocimiento: de factores, de enfermedades, de malformaciones, etc...Y a partir de eso, ir desarrollando aún mas la ciencia y la tecnología para encontrar soluciones a diversos factores y la cura de ciertas enfermedades y síndromes.

Tema 3: Análisis de cariotipos:

CONCLUSIONES: El análisis de un cariotipo es fundamental en las etapas prenatales. Al extraerle la información genética a un individuo en desarrollo prenatal, se abre una totalidad de posibilidades de saberlo todo acerca de ese nuevo individuo, pero principalmente sus defectos congénicos, malformaciones, mutaciones, síndromes, salud, etc...Y en la actualidad, con la ingeniería genètica, se busca curar dichas enfermedades congénicas.

Es un gran paso del mundo moderno, pues, aunque algunas veces no hay cura posible, se prepara psicológicamente a los padres para la formacion de niños retrasados, sin algunas extremidades, locos, ciegos, etc...todas las posibilidades de un error genético.

Permite incluso determinar cómo se va a tratar en un futuro a ese individuo, que medicamentos necesitaría, que facilidades, que tipo de educación, todo ese tipo de cosas. Su importancia radica en la planeación que esta tecnología permite y , en un futuro no muy lejano, la  prevención, cura y tratamiento de enfermedades congénicas y posnatales.

DISCUSIÓN: Me parece que el análisis de cariotipos es un tipo de tecnología o ciencia que va ir en aumento, dada su gran utilidad en la predicción de todo tipo de anormalidades congénitas. No es extremadamente complicado o caro. Por todo esto se presta para ser un recurso práctico y muy útil, tanto para los nuevos individuos (para decidir previamente cómo tratar su enfermedad o, en un futuro cercano, curar dicha enfermedad-ingeniería genética) como para sus padres (para prepararse psicológica y técnicamente-como van a formar a su hijo)

Tema 4: Tècnicas de análisis de ADN:

CONCLUSIONES: Èste es el tema que más aplicaciones tiene en la sociedad actual, pues la tecnología ya está muy desarrollada y es totalmente aplicable, no como la ingeniería genética que aún le falta por desarrollarse.

Las técnicas de análisis de ADN, el análisis de ADN se puede ver en las pruebas de paternidad (y en contados casos de maternidad), casos ante la ley, crimenes, tratamiento de enfermedades, detección de enfermedades, etc...

Éstas técnicas se basan principalmente de extraerle el ADN a un individuo. Parece complicado en una primera percepción, pero hay una gran variedad y multiplicidad de formas para llevar a cabo dicha extracción: muestras de sangre, muestras bucales, pelos con raìz, huellas, etc...

Ya con estas muestras, los laboratorios se encargan de identificar el ADN de esa muestra, con procesos a ciertas temperaturas, el uso de enzimas (especialmente las de restricción que cortan el ADN a la mitad para luego amplificarlo), la exposición a rayos x y todo básicamente para amplificar ciertas secuencias para determinar la procedencia deADN.

Por lo anterior se puede afirmar que éstas técnicas son inmensamente útiles para la sociedad actual, por sus múltiples usos (desde crímenes hasta pruebas de paternidad). Son esos avances de la tecnología y la ciencia que le abren puertas a la humanidad, permiten más progresos, generan más inventos e innovaciones, etc...

DISCUSIÓN: Me parece que este es un grandioso avance de la tecnología puesto, más que todo, en servicio de la ley, dada la cantidad de usos que se le da en términos de justicia. Desde una prueba de paternidad en casos de demandas y pequeñas tutelas (o sólo por curiosidad o verdad) hasta crímenes internacionales en los cuales identificar el individuo es esencial para el desarrollo del caso.

Se encuentra que desde pelos, o sangre, o saliva pueden llegar a determinar, mediante complicados métodos y la ayuda de la tecnología y los laboratorios, la identidad de una persona. Desde una simple secuencia de ADN entre millones más se puede lograr eso. Y con muchos métodos, como las huellas, la amplificación de las secuencias, etc...

Tema 5: Modificación genética y sus usos:

CONCLUSIONES: Èste tema tambièn tiene tantas (si no son más) aplicaciones en la humanidad. Y todo porque se puede relacionar con un sinfín de cosas: armas biológicas, cura de enfermedades hasta entonces incurables, tratamientos médicos, producción agrícola y ganadera, etc...

La modificación genética es, básicamente, un cambio en la información genética preexistente de un organismo, reemplazándola por otra información, de la misma característica o función, de otro organismo. Éste otro organismo no tiene que ser necesariamente parecido al anterior. Por ejemplo, se puede insertar información genética de un virus (que ni siquiera es un ser vivo) o una bacteria-estructuras muy básicas- a una planta o animal-los cuales vienen a ser organismos, seres vivos con un nivel de complejidad extremadamente mayor)

También presenta controversia, básicamente porque estas actividades proponen al hombre como imitador de Dios (bàsicamente en clonaciones reproductivas), lo cual, desde un punto de vista ètico, moral y religioso, no esta bien visto.

DISCUSIÓN: Me parece que el fin que se utiliza, la modificación genética, no es malo, sino el fin de cualquier modificación: clonaciones humanas, de plantas, animales o cualquier ser vivo (que es visto como jugar a ser Dios). La modificación en sí, no tiene nada de malo. Hay incluso muchas aplicaciones de la modificacione genética que son buenos. Por ejemplo tratar de encontrar la cura para enfermedades como el sida y el càncer, aumentar la productividad y calidad de plantas y animales, determinar los productos que distintos seres vivos modificados genéticamente pueden llegar a producir, inmunizar seres vivos contra plagas-climas adversos-enfermedades-etc...Muchas aplicaciones buenas.

Y la modificación es, básicamente reemplazar determinadas secuencias de ADN por otras deseables que cumplan con los propósitos de la modificación (anteriormente descritos)

Tema 6: Clonación en animales y plantas:

CONCLUSIONES: Se puede ver desde distintos focos: crear nuevos organismos o individuos, crear determinados tejidos para determinados individuos, influir en los productos de ciertas especies de plantas y animales para conseguir nuevos y deseados productos o mejorar la calidad de los mismos, etc...

El màs atacado por la controversia mundial es la creación de nuevos organismos, por la incompetencia de los mismos, sus errores de fabricación , posibles malformaciones genèticas-genotípicas o fenotípicas o ambas-, vida màs corta, su incapacidad (en algunos casos) para adaptarese a los ecosistemas y su medio ambiente, etc...Pero la principal es cómo el hombre juega a ser Dios, lo cual representa una violación a los códigos morales y religiosos.

En los otros caso es excelente, pues habrá mayor productividad y mejores productos, lo que significará un mayor desempeños económico y una mayor cobertura en aspectos como la alimentación mudial (eso contando con que se emplee bien la producción). Además de tratamientos veterinarios y en general, un mejoramiento de las razas.

DISCUSIÓN: Me parece que es un tema interesante, complejo, con muchas aplicaciones y a la vez mucha controversia. Pero con tal de que el organismo clonado no sea un ser humano, o al menos un ser vivo no veo mal en éstas prácticas. El factor ético que a mi me parece está en desacuerdo con la clonación de seres vivos completos es la "falta de respeto" del hombre hacia la labor creadora de Dios, además de los perjuicios causados a los seres vivos clonados: defectos genéticos o congénitos, malformaciones, vida más corta, errores genotípicos y fenotípicos, etc...

Lo correcto me parece que és la utilización de estos métodos si se beneficia el ser humano o , al menos, no hay actos malos o inmorales. Dentro de actos que benefician puede estar la clonación de órganos para cuando no halla donantes no se mueran los pacientes, por ejemplo

sábado, 4 de septiembre de 2010

El último tema de clonación en plantas y animales, con sus ventajas, beneficios y desventajas está en la última presentación. A continuación, un análisis bioético.

Primero, es menester aclarar que hay dos tipos de clonación: la reproductiva (crear otro organismo igual a su progenitor) y la terapéutica (agregar células madres de un organismo a otro, sin rechazos inmunológicos). La primera es meramente una aplicación de la tecnología de punta, dependiendo de la complejidad del organismo a clonarse. Pero el fin no es en términos de productividad, o cura o tratamiento de enfermedades. Sólo es algo experimental, que no tiene consecuencias mayores a la simple creación de un organismo más y ya. En caso de que la clonación no sea un simple experimento, se puede llegar a clonar órganos (lo cual evitaría donantes de órganos para transplantes), clonaciones en masa de animales o plantas para evitar su extinción, etc...Sus desventajas radicarían en el impacto de los organismos clonados contra el medio ambiente(organismos "diferentes" que afectan la evolución, las interacciones, etc...) y ellos mismos (mayor porcentaje de malformaciones y mutaciones, duración de vida más corta, etc...).

El segundo tipo de clonación es el más común, por su menor complejidad y sus mayores aplicaciones en la realidad. De éste, se tienen aplicaciones relacionadas con la productividad de animales y plantas, tratamiento de enfermedades, inmunidad contra ciertos tipos de virus, productos químicos o industriales, enzimas, etc...Se usa de la ingeniería genética-adn recombinante, enzimas de restricción-para aislar genes de un organismo e implantarlo en otro, para que produzca ciertas sustancia, proteínas, enzimas, o desarrolle ciertas características, previamente deseadas. El fin es bueno, siempre y cuando no sea, como casi siempre se da, buscando solamente mayor renta. Si esa tecnología se pusiera para alimentar más gente, aliviar a más gente, y cosas por ese estilo es bueno. Casi siempre se usa sólo en términos de beneficio económico.

El problema ético radica más en cómo el hombre juega a ser Dios, a crear organismos, e incluso a veces a obrar mal (virus contagiosos-armas biológicas). El medio no tiene nada de malo (al menos la sola tecnología). Lo malo radica en cómo se usa esa tecnología. Si sólo se usara para producir más alimentos, o proteger las cosechas, o aliviar enfermedades, estaría bien.

Clonacion 2

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La Clonacion 222222

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Ingenieria Genetica

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Tema 16 el adn y la ingenieria genetica

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Genetica

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5 Genetica Forense

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Pcr Y Electroforesis Biociencias 2010 Pdf

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Herencia Y GenéTica

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ADN

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ADN
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Estructura Del ADN

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miércoles, 1 de septiembre de 2010

PREGUNTA PROBLEMA:

Dos usos de modificación genética: Expuestos en la presentación.

Las manipulaciones o modificaciones genéticas, hablando a un nivel por encima de lo meramente biológico, tiene ciertos contrapuntos, ventajas, desventajas, desacuerdos, etc...

Lo que si es recalcable, es que el fin logrado siempre es productivo o muy bueno. Es mejorar, casi que sin límites, un organismo preexistente, con un determinado fin o propósito. Generalmente se usa en seres vivos como plantas, animales, o bacterias, para aumentar su productividad, determinar sus productos, hacerlos inmunes ante plagas y cosas por ese estilo, producir ciertas sustancias o nutrientes, en fin...En términos de avances tecnológicos, productividad, mejoras económicas es algo totalmente innovador y de eficaces resultados.

La cuestión aparece es ya con temas morales, éticos y religiosos. Y son generalmente cuando la ingeniería genética hace "el trabajo de Dios". Cuando hay clonaciones, cambios en fetos o embriones por simple capricho, en fin, cosas que no están marcadas por una necesidad extrema que justifica dichas manipulaciones, se habla de atropellos contra la ética y la religión. Se ve al hombre que juega a ser Dios, lo cual, desde el punto de vista religioso, es malo.

Ya en el punto de vista ético entran en juego factores económicos como la competitividad en los mercados de ciertos productos manipulados genéticamente. Potencias que utilizan su poderío y tecnología para opacar otras economías menores o emergentes. Otros factores son las manipulaciones por capricho de fetos para adecuarlos a los gustos de los progenitores. No está bien éticamente, claro que ante todo está la libertad.

En fin, son factores que ya entrarán en la conciencia de cada uno. Son subjetivos y ante todo está la libertad. Ya depende de las personas pensar si está bien o no.


Tema 16 el adn y la ingenieria genetica

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jueves, 26 de agosto de 2010

TEMA 8: MODIFICACIÓN GENÉTICA:


Biotecnología es un término muy amplio que en su definición admite asociarlo a cualquier técnica que utiliza organismos vivos para crear nuevos productos, para mejorar los rendimientos de plantas o animales, o para desarrollar microbios con fines específicos. Su definición incluye los métodos tradicionales de cultivo de plantas, ganadería y procesos de fermentación conocidos desde la antigüedad. Y a la vez también recoge métodos de la biotecnología moderna, como el uso industrial del ADN recombinante (ácido desoxiribonucleico), la fusión de células o las nuevas técnicas de bioprocesado.

Una parte importante de la biotecnología moderna es la interpretración, intercambio y modicación de los genes, las unidades responsables de la heredabilidad de los caracteres, como son el rendimiento de un cultivo, el color de una fruta o los enzimas producidos por un tipo de levadura.

La información que contienen los genes puede ser transferida entre distintas especies de animals, plantas o bacterias para obtener algunos resultados específicos. Por ejemplo, los genes de una proteína de origen bacteriano que es capaz de eliminar una plaga de un determinado insecto ha sido introducido con éxito en una serie de cultivos, reduciendo la necesidad de usar insecticidas químicos. Además de poderse tranferir genes de una especie a otra, también es posible ‘inactivar’ secuencias indeseadas. Por ejemplo esta técnica ha sido empleada para inactivar el gen responsable del reblandecimiento del tomate, obteniendo así un producto mucho más duradero.

Un organismo modificado genéticamente (abreviado OMGOGM o GMO, este último del inglés Genetically Modified Organism) es aquel cuyo material genético es manipulado en laboratorios donde ha sido diseñado o alterado deliberadamente con el fin de otorgarle alguna característica específica. Comúnmente se los denomina transgénicos y son creados artificialmente en laboratorios por ingenieros genéticos.
Las técnicas de ingeniería genética que se usan consisten en aislar segmentos del ADN (material genético) para introducirlos en elgenoma (material hereditario) de otro, ya sea utilizando como vector otro ser vivo capaz de inocular fragmentos de ADN (Agrobacterium tumefaciens, una bacteria), ya sea bombardeando las células con micropartículas recubiertas del ADN que se pretenda introducir, u otros métodos físicos como descargas eléctricas que permitan penetrar los fragmentos de ADN hasta el interior del núcleo, a través de las membranas celulares.
Al ser la manipulación en el material genético, este es hereditario, puede transferirse a la siguiente generación salvo que la modificación esterilice al organismo transgénico.

¿Qué son los genes y dónde se encuentran?
Existen genes en todo aquello que está vivo, o que estuvo vivo. Existen genes en las personas, las moscas, el jamón, el tomate, las bacterias etc. Un filete de 200 g contiene 750.000.000.000.000 genes.

Un gen es un código que rige nuestro aspecto físico y nuestras características. Existen, por ejemplo, genes que deciden si vamos a tener los ojos azules o castaños. La mitad de nuestros genes son heredados de la madre y la otra mitad del padre.
Las plantas también tienen genes. Éstos deciden el color de las flores y la altura que una planta podrá alcanzar. Como en las personas, las características de una planta serán transferidas a sus "hijos": las semillas que crecen y se transforman en nuevas plantas.
¿Qué es la modificación genética?
La modificación genética altera los genes y, consecuentemente, las características del individuo. Es posible, por ejemplo, modificar genéticamente fresas para que se mantengan frescas durante más tiempo, y el arroz puede ser modificado genéticamente de forma que contenga un mayor valor vitamínico.

Cuando un científico modifica genéticamente una planta, introduce un gen extraño en los genes de la propia planta. Puede ser, por ejemplo, un gen de una bacteria resistente al pesticida. Como resultado, la planta modificada genéticamente hereda las características contenidas en el código genético, y se hace apta también para soportar los pesticidas.
Con la modificación genética, es posible transferir genes de una especie a otra. Esto es así porque todos los genes, tanto humanos como vegetales, animales o bacterianos son creados a partir del mismo material. Los científicos genéticos disponen así de una enorme cantidad de características genéticas donde elegir.
¿Cómo trabaja un científico genetista?La modificación genética de las plantas ocurre en varias fases:
1.El científico encuentra y aisla el gen con las características genéticas deseadas. Este proceso se denomina cartografía.
2.Se hacen varias copias del gen aislado. El proceso de copia se denomina PCR.
3.Se transfieren los genes deseados a los genes de las propias plantas (utilizando un pedazo de tejido de la planta). Para introducir los genes deseados en la planta, el científico tiene tres opciones. Puede utilizar un "cañón de genes", una bacteria del suelo o un material llamado protoplasto. Los métodos de inserción de genes se llaman transformación.
4.Se crea una nueva planta a partir del tejido de la planta modificada genéticamente.
5.Se verifica si los genes insertados funcionan conforme a lo esperado.
6.Se verifica también si el gen introducido aparece en las semillas de la planta.
¿Cómo sabemos si la modificación genética fue correcta?Raramente se puede ver a simple vista si una planta o un animal ha sido modificado genéticamente. Los científicos desarrollan, para esto, algunas técnicas útiles que les sirvan de ayuda.
Por ejemplo, existe un test de coloración especial que permite identificar si una planta está modificada genéticamente. Cuando la planta está modificada genéticamente, el científico inserta un "gen marcador" suplementario en la planta. El gen marcador puede tener diversas características; por ejemplo, el cambio de color de la planta cuando se expone a un test químico.
De este modo, los científicos pueden identificar si la planta fue o no genéticamente modificada efectuando un test químico y verificando el color de la planta.
¿Cuál es la diferencia entre la modificación genética y el procedimiento tradicional?Mucho antes de descubrir la modificación genética, los agricultores ya mejoraban sus cultivos a través de aquello que llamamos hoy "procedimiento tradicional".
El procedimiento es el cruce de los ejemplares mejores, mayores, más bonitos o más sabrosos de una cierta especie unos con otros de forma que se obtenga una planta o un animal aún mejor, mayor, más bonito o más sabroso.
En el procedimiento tradicional, los genes se transfieren de una planta a otra. Este es también el caso de la modificación genética, pero el modo de hacerlo es muy diferente.
La modificación genética es una técnica más precisa, en la que se puede ser exacto en la transferencia de las características deseadas. En el procedimiento tradicional, no es posible evitar la eventualidad de transferencia de otras características.
En el procedimiento tradicional, las características sólo pueden ser permutadas entre especies idénticas o muy semejantes. En la modificación genética, las características pueden ser transferidas de una especie a otra muy diferente, y lo mismo ocurre entre plantas y animales.
La modificación genética se produce más rápidamente que el procedimiento tradicional.
¿De qué otras formas pueden ser alterados los genes?
No sólo se utiliza la modificación genética para alterar los genes de plantas y animales.

Las alteraciones espontáneas, la radiación, los productos químicos y el procedimiento tradicional también pueden alterar las características de una planta o animal.
La alteración espontánea de genes ocurre naturalmente, y a veces sin ninguna eficacia. Una alteración espontánea puede llevar al desarrollo de características positivas y negativas. El método no es muy adecuado si la intención es crear alteraciones específicas.
La radiación y los químicos pueden ser utilizados para efectuar la alteración genética. Ambos elementos se utilizan en el procesamiento de plantas.
En el procedimiento tradicional se cruzan plantas y animales muy idénticos. Podrá ser el maíz y el nabo redondo o un caballo y un burro. De este modo, ocurren diversas combinaciones de genes en la progenitura. Los especímenes con características deseables son seleccionados a lo largo de varias generaciones. Los cultivos y el ganado que vemos hoy son el resultado del procedimiento tradicional.
¿Todo puede ser modificado genéticamente?
Sí. En principio cualquier cosa viva puede ser modificada genéticamente: animales, personas, plantas y bacterias.

En otras palabras, es posible transferir características de un pez a una fresa. Pero cuanto más diferentes sean las especies, más difícil es. Lo más fácil es modificar genéticamente las especies más semejantes.
No todas las características pueden ser transferidas. Algunas características ocurren sólo por la interacción entre gran cantidad de genes. Muy raramente los científicos tienen una perspectiva suficientemente buena de esta interacción para poderla recrear.
Actualmente, los científicos trabajan intensamente en la cartografía de genes en los humanos y en los cerdos. Tal vez esto les proporcione conocimientos y perspectivas suficientes para que en el futuro puedan crear modificaciones genéticas aún más complejas que las actuales.

domingo, 22 de agosto de 2010

TEMA 7: TÉCNICAS DE ANÁLISIS DE ADN:

A. PCR (REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA:
La reacción en cadena de la polimerasa (conocida como PCR por sus siglas en inglés, Polymerase Chain Reaction) permite amplificar más de un millón de veces un ADN obtenido a partir de una región seleccionada del genoma, siempre y cuando se conozca una parte de su secuencia de nucleótidos. Esta técnica fue ideada en 1989 por Kary B. Mullis que obtuvo el premio Nobel de Química en 1993 por dicho invento.
Para la PCR se utilizan dos oligonucleótidos sintéticos de unos 15-20 nucleótidos que son complementarios a las zonas flanqueantes de la región que se quiere amplificar. Estos oligonucleótidos (habitualmente conocidos por su nombre en inglés, "primers") actúan como cebadores para la síntesis in vitro de ADN la cual está habitualmente catalizada por una enzima llamada Taq polimerasa. Dicha enzima se aísla de una bacteria termófila, denominada Thermus Aquáticus, que es capaz de crecer a temperaturas elevadas (79 - 85 º C). A esta temperatura dicha enzima es capaz de mantener una media de extensión de más de 60 nucleótidos por segundo en regiones ricas en uniones G-C. La temperatura optima a la que actúa la Taq polimerasa permite el uso de elevadas temperaturas para la unión de los primers y para la extensión, de esta manera se aumenta el nivel de exigencia de la reacción y se reduce la extensión de los primers unidos inespecíficamente al ADN.
La reacción se lleva a cabo en una serie de  ciclos cada uno de los cuales incluye tres fases o pasos:
  1. DESNATURALIZACIÓN:  Para que comience la reacción es necesario que el ADN molde se encuentre en forma de cadena sencilla. Esto se consigue aplicando temperaturas de 90 a 95ºC que producen la rotura de los puentes de hidrógeno intercatenarios y por lo tanto la separación de ambas cadenas. Para conseguir la completa separación de las hebras de toda la muestra esta temperatura debe mantenerse unos minutos. Si el ADN solo se desnaturaliza parcialmente éste tenderá a renaturalizarse rápidamente, evitando así una eficiente hibridación de los primers y una posterior extensión.
  2. HIBRIDACIÓN:  Esta fase se denomina también fase de “annealing” o de emparejamiento. Una vez que el ADN está desnaturalizado se disminuye la temperatura hasta un rango comprendido entre los 40 y los 60ºC para que se pueda producir la unión de los primers a las secuencias flanqueantes del fragmento que se va a amplificar. La temperatura de fusión o annealing (Tm, “melting temperature”) depende de varios factores y es relativamente específica para cada primer. La longitud de los primers y la secuencia son críticas en la designación de los parámetros de una amplificación, una fórmula simple para calcular la Tm es la siguiente: 
Tm = 4(G+C) + 2 (A+T).
No obstante, cada primer exige una serie de estudios experimentales para determinar su temperatura de annealing específica ya que si la temperatura es muy baja la unión se hará de forma inespecífica y si es muy alta no se producirá una unión completa.
  1. EXTENSIÓN:  Durante este paso la Taq polimerasa incorpora nucleótidos en el extremo 3' del primer utilizando como molde la cadena de ADN previamente desnaturalizada. La temperatura a la que se lleva a cabo este paso suele ser de 72ºC ya que es la temperatura a la que la Taq polimerasa alcanza su máxima actividad. Normalmente una extensión de 20 segundos es suficiente para fragmentos menores de   500 pb, y 40 segundos para fragmentos por encima de 1.2Kb.
Un factor importante en el transcurso de las diferentes fases es el tiempo de rampa. Este se define como el tiempo invertido en pasar de una temperatura a otra y depende del diseño y de las características del aparato donde se realiza automáticamente este proceso, el termociclador. En las nuevas generaciones de termocicladores este factor se ha ido optimizando para hacerlo mínimo.

2.2  Componentes de la PCR

2.2.1  BUFFER DE AMPLIFICACIÓN

Los buffer de PCR que se utilizan normalmente contienen KCl, Tris y MgCl2.  El MgCl2 es el componente que más influye en la especificidad y rendimiento de la reacción ya que los iones Mg2+ son necesarios para la actividad de la Taq polimerasa, es decir, actúan como cofactores de la polimerasa. 
La concentración óptima de MgCl2 está en torno a 1.5 mM si se emplean concentraciones de 200 mM de cada uno de los dNTPs. No obstante, a veces es necesario probar con diferentes cantidades de Mg ya que un exceso del mismo origina una acumulación de productos inespecíficos y una cantidad insuficiente hace que disminuya el rendimiento de la amplificación.

2.2.2  PRIMERS

A la hora de elegir unos primers para amplificar un determinado fragmento de ADN hay una serie de reglas a seguir:
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La longitud de cada uno de los primers debe estar comprendida entre 18 y 24 bases ya que se ha comprobado que primers de mayor longitud (30-35 bases) no aumentan el rendimiento y los primers cortos carecen de suficiente especificidad.
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Ambos primers deben tener una Tm similar (como mucho la diferencia entre ambas temperatura debe ser de 5ºC).
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La relación bases púricas: bases pirimidínicas debe ser 1:1 (o como mucho 40-60%).
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 La secuencia de los primers debe comenzar y terminar con 1-2 bases púricas.
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Para evitar la formación de dímeros de primers es necesario comprobar que  los primers no contengan secuencias complementarias entre sí.
Los dímeros de primers consisten en fragmentos de doble cadena cuya longitud es muy próxima a la de la suma de los primers y se producen cuando un primer es extendido a continuación del otro. El mecanismo exacto por el que se forman estos dímeros no está completamente determinado. La observación de que primers con los extremos 3' complementarios favorecen su formación sugiere que el paso inicial se debe a interacciones transitorias que aproximan los extremos complementarios. Algunas polimerasas, incluida la Taq, han mostrado una débil actividad polimerizadora no dirigida por un ADN patrón, la cual puede unir nucleótidos adicionales al doble extremo apareado. Si esta actividad puede producirse sobre una hebra sencilla de oligonucleótidos, resultaría una buena oportunidad para que la extensión formara un corto solapamiento en el extremo 3' con el otro primer, suficiente para promover la formación del dímero.

2.2.3  DESOXINUCLEÓTIDOS TRIFOSFATOS

Las concentraciones de dNTPs que suelen usarse están en torno a 200 µM para cada uno de ellos. En un volumen de reacción de 25 µl con esta concentración de dNTPs se sintetizarían entre 6-6.5 µg de ADN. La concentración de dNTPs y de MgCl2 va relacionadas ya que el Mg se une a los dNTPs con lo que concentraciones elevadas de dNTPs inhibirían la reacción al no tener la Taq polimerasa suficiente Mg como para incorporar dNTPs. Para una concentración de 200 µM de cada dNTP se suele añadir MgCl2 a una concentración de 1.5 mM.

2.2.4  TAQ-POLIMERASA

Las cantidades óptimas de Taq polimerasa necesarias para la síntesis de ADN están alrededor de 2 unidades en 25 µl de volumen final de reacción. La actividad de este enzima se ve influenciada por la concentración de dNTPs, de Mg2+ y de algunos iones monovalentes de manera que concentraciones elevadas de los mismos inhiben dicha actividad.
Por otro lado, pequeñas concentraciones de KCl estimulan la actividad sintética de la Taq en un 50-60% con un máximo aparente cuando su concentración es de 50 mM. Existen algunos datos relacionados con la influencia de ciertos reactivos que se emplean antes de la amplificación y que alteran la actividad de la Taq. Por ejemplo concentraciones 1M de urea estimulan la actividad, el SDS a bajas concentraciones que la inhibe al igual que concentraciones mayores del 10% de etanol. 

2.2.5  ADN MOLDE O “TEMPLATE"

Es el ADN del cual queremos copiar un determinado fragmento, es, por tanto, el ADN que la Taq polimerasa utiliza como molde para la síntesis de nuevas cadenas polinucleotídicas. La cantidad de ADN necesaria para la PCR depende de varios factores:
Del marcador que se va a amplificar: hay marcadores cuyos primers son más específicos o bien cuyas condiciones de amplificación están mejor optimizadas que las de otros. Por esta razón puede darse el caso de que cierta cantidad de ADN (sobre todo cuando jugamos con cantidades mínimas) amplifique para unos marcadores pero no para otros. Por ello, cuando en un laboratorio se va a utilizar un nuevo marcador es necesario hacer un estudio de validación en él que se incluye un estudio de sensibilidad. De dicho estudio de sensibilidad puede sacarse como conclusión cuál es la mínima cantidad de ADN que amplifica en condiciones estándar. De manera general, para casi todos los STR utilizados en Genética Forense la cantidad óptima de ADN que asegura un rendimiento adecuado está en torno a los 5 ng.
Calidad del ADN: Cuando se trabaja con ADN cuya calidad es óptima no suele haber problemas en la amplificación y cantidades del mismo por encima e incluso por debajo de los 5 ng rinden buenos resultados. El problema aparece cuando la calidad del ADN obtenido no es la idónea, bien porque esté degradado o bien porque dicho ADN vaya ligado a una serie de contaminantes que pueden inhibir la actividad de la polimerasa. Si el ADN está degradado por la acción de enzimas de restricción el que obtengamos o no resultado en la amplificación va a depender de que el fragmento a amplificar haya sido dañado o no. En el caso en el que tengamos ADN sin degradar pero unido a una serie de contaminantes habría que intentar diluir al máximo la muestra para disminuir dichos contaminantes, pero siempre dentro de un rango de ADN que no esté por debajo del límite de sensibilidad de la PCR. El problema de las cantidades mínimas de ADN y la presencia de contaminantes o inhibidores de la Taq es un hecho habitual en Criminalística y requiere un estudio pormenorizado de la muestra antes de la amplificación.


B. RFLP:
El análisis consiste en hacer un Southern Blotting (o "Southern blot" que es un método de biología molecular que sirve para verificar si una determinada secuencia de ADN está o no presente en una muestra de ADN analizada) y usar sondas específicas para detectar los VNTR (repeticiones en tandem de número variable).
En primer lugar el ADN que se va a analizar se separa de otros materiales. A continuación, debe cortarse en piezas de diferentes tamaños usando enzimas de restricción, que son proteínas que cortan el ADN sin dañar las bases. las piezas son clasificadas por tamaño mediante electroforesis en gel. Las piezas con carga positiva se van a la parte superior. El ADN que tiene una ligera carga negativa natural es atraído hacia el fondo. Las piezas más pequeñas se mueven más rápidamente a través del gel, por lo que será aún más hacia la parte inferior de las piezas grandes. Al separar las piezas por tamaño, los más altos se mantienen arriba y los más pequeños debajo. Luego por calor o solución alcalina, se aplica gel con el fin de desnaturalizar el ADN y se separa en fragmentos individuales. Una vez realizado esto el ADN esta ahora listo para ser analizados utilizando una sonda radiactiva de reacción de hibridación.
Para hacer la sonda radiactiva, se necesita la polimerasa del ADN. El ADN que se va someter a la radiactividad se coloca en un tubo de ensayo. A continuación se agrega la polimerasa en el tubo. Se disuelve y se espera a que comience a funcionar. Como los parches de polimerasa de ADN rompen el ADN, los actuales son sustituidos por los nuevos nucleotidos en el tubo. Cada vez que la muestra tenga una base Guanina, la Citosina será puesto en radiactividad. En la repetición del ADN, la polimerasa también se vuelve radioactiva. Las piezas radioactivas están listas para su utilización. Ahora la sonda radioactiva puede ser usada para crear una reacción de hibridación. La hibridación sucede cuando dos secuencias genéticas se unen a causa del hidrógeno que se encuentra en los pares de las bases. Hay dos de estos entre Adenina o Timina y tres de Citosina o Guanina. Para realizar la hibridación el ADN tiene que estar desnaturalizado.
El ADN desnaturalizado radioactivo y la sonda deber ser puestos en una bolsa de plástico con líquido salino y sellado fuertemente. La sonda se adherirá a la desnaturalización de ADN dondequiera que se encuentre de forma apropiada. La sonda y el ADN no tienen que encajar de forma exacta. Este proceso termina haciendo un patrón de ADN de las huellas digitales. Toda persona tiene un VNTRs que ha heredado de uno de sus padres y los VNTRs son únicos para cada persona.



C. AMP FLP:
Se trata de una técnica de amplificación de regiones polimórficas (con muchos polimorfismos [6]), preferiblemente el lócus D1S80. Este análisis pueden ser automatizado, y permite la fácil creación de árboles filogenéticos basados en la comparación de las muestras individuales de ADN.
Basado en el número variable de repetición en el tandem (VTNR) para distinguir diversos polimorfismos alelos, que son separados en un gel de poliacrilamida utilizado en una escalera alelica (en oposición a un peso molecular). Bandas podrían ser visualizados por tincíon de gel de plata. Un lugar popular para la toma de huellas dactilares es el locus D1S80. Al igual que los métodos basados en PCR, el ADN degradado o en cantidades muy pequeñas de ADN puede causar alélica de abandono.
Debido a su costo relativamente bajo y la facilidad para su puesta en marcha y operación, AmpFLP sigue siendo popular en los países de bajos ingresos.


D. STR:
Consiste en la amplificación de secuencias con pequeñas repeticiones en tandem que no se conservan dentro de la especie. Una vez amplificadas se separan los fragmentos para comprobar el número de repeticiones (mediante electroforesis capilar o en gel), de forma que se pueden distinguir patrones de repeticiones que pueden ser comparables y asociables.
Este método usa regiones altamente polimórficas que tienen secuencias cortas repetidas de ADN (el más común es de 4 bases repetidas, pero hay otras longitudes en uso, incluyendo bases 3 y 5). Porque diferentes personas tienen diferentes números de unidades de repetición y estas regiones de la DNA se puede utilizar para diferenciar entre las personas. Estos STR loci (lugares) son atacados con primers específicos de secuencia y se amplifican mediante PCR. Los fragmentos de ADN que son resultado entonces detectados y separados mediante electroforesis. Existen dos métodos de separación y detección, la electroforesis capilar (CE) y la electroforesis en gel.
Los polimorfismos STR mostrados en cada región son de por sí muy comunes, por lo general, cada polimorfismo es compartida por alrededor de un 5 - 20% de las personas. Cuando observamos múltiples loci, es la única combinación de estos polimorfismos de un individuo que hace que este método de discriminación sea un instrumento de identificación. Las regiones STR que se ponen a prueba en una persona se convierten en una discriminación de la prueba.
De un país a otro existen diferentes sistemas STR en el análisis de ADN que están en uso. En América del Norte los sistemas que amplifican el CODIS 13 loci núcleo son casi universal, mientras que en el Reino Unido, el sistema de SGM +, que es compatible con la base de datos nacional de ADN esta en uso. Cualquiera que sea el sistema utilizado, muchas de las regiones STR usadas en la prueba son los mismas. Estos sistemas de análisis de ADN se basan en torno a las reacciones múltiplex, el cual muchas regiones STR será sometido a prueba en el mismo tiempo.
La Electroforesis capilar (movimiento mediante la aplicación de un campo eléctrico), permite la inyección de fragmentos de ADN en un tubo de vidrio delgado (capilar) llena de polímeros. El ADN es extraído a través del tubo por la aplicación de un campo eléctrico, la separación de los fragmentos ocurre de tal manera que los más pequeños fragmentos de viajan más rápido a través de los capilares. Los fragmentos son entonces detectados utilizando colorantes fluorescentes que se adjunta a los primers utilizados en la PCR. Esto permite que múltiples fragmentos amplificados se ejecuten de manera simultánea, algo conocido como multiplexación. Luego se asignan tallas utilizando el tamaño del ADN como normas de etiquetado que se añaden a cada muestra, y el número de repeticiones se determinan comparando el tamaño de la escalera alélica, que contiene una muestra de todos los tamaños comunes de las posible repeticiones. Aunque este método es costoso, con mayor capacidad de las máquinas y un mayor rendimiento de las que se están utilizando para reducir el costo/muestra es posible reducir los retrasos que existen en muchas instalaciones de la delincuencia gobierno.
Electroforesis en gel es uno de los actos que es utilizado usando principios similares conocidos como "CE", pero en lugar de utilizar un capilar, el gran gel de poliacrilamida se utiliza para separar los fragmentos de ADN. Un campo eléctrico es aplicado, como en la CE, pero en lugar de correr todas las muestras por un detector, los fragmentos más pequeños se ejecutan cerca de la parte inferior del gel y todo el gel es escaneado y guardado en un ordenador. Esto produce una imagen que muestra todos los de las bandas correspondientes a diferentes tamaños y repite la escalera alélica. Este método no requiere el uso de las normas de tamaño, ya que la escalera alélica se ejecuta junto con las muestras y sirve para este propósito. La visualización puede ser a través de la utilización de marcados tintes fluorescentes primers en la tinción de plata o por el gel antes de escanear. A pesar de que es rentable y puede ser de bastante alto rendimiento, para aplicar la tinción de plata ITS se suspende. Además, muchos laboratorios están eliminación gradualmente geles a favor de la CE, haciendo el costo de las máquinas se haga más manejable.
El verdadero poder del análisis STR se encuentra en el poder estadístico de la discriminación. En los EE.UU., hay 13 centrales loci (lugares de ADN) que se utilizan actualmente para la discriminación en el CODIS. Debido a que estos lugares usan una variedad de forma independiente (con un determinado número de repeticiones en un locus no cambia la probabilidad de tener cualquier número de repeticiones en cualquier otro lugar), el producto de la regla de probabilidades se pueden aplicar. Esto significa que si alguien tiene el ADN de tipo ABC, en el que los tres loci son independientes, podemos decir que la probabilidad de que ese tipo de ADN es la probabilidad de tener tipo A veces la probabilidad de tener el tipo B veces es la probabilidad de tener el tipo de C. El método de mayor prevalencia de ADN de las huellas dactilares utilizados en la actualidad está basado en la PCR y utiliza corto repite tándem (STR). Este método usa regiones altamente polimórficas que han repetido secuencias cortas de ADN (el más común es de 4 bases repetidas, pero hay otras longitudes en uso, incluyendo bases 3 y 5). Porque diferentes personas tienen diferentes números de unidades de repetición, estas regiones de la DNA se puede utilizar para discriminar entre las personas. Estos STR loci (lugares) son atacados con primers específicos de secuencia y se amplifican mediante PCR. Los fragmentos de ADN que son resultado entonces detectados y separados mediante electroforesis. Existen dos métodos de separación y detección, la electroforesis capilar (CE) y la electroforesis en gel.
Los polimorfismos STR mostradas en cada región son de por sí muy común, por lo general, cada polimorfismo será compartido por alrededor de un 5 - 20% de las personas. Cuando observamos múltiples loci, la única combinaciones de estos polimorfismos de un individuo hace que este método de la discriminación sea un instrumento de identificación. Las demás regiones STR que se ponen a prueba en una persona se convierten en una discriminación de la prueba.


E. MITOCONDRIAL:
Se usa en muestras muy degradadas, ya que el DNA mitocondrial posee más copias que el nuclear. Se amplifican las regiones HV1(región en el ADN mitocondrial) y HV2 y se comparan siempre con familiares por parte materna ya que las mitocondrias son herencia ex