TEMA 7: TÉCNICAS DE ANÁLISIS DE ADN:

A. PCR (REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA:

La reacción en cadena de la polimerasa (conocida como PCR por sus siglas en inglés, Polymerase Chain Reaction) permite amplificar más de un millón de veces un ADN obtenido a partir de una región seleccionada del genoma, siempre y cuando se conozca una parte de su secuencia de nucleótidos. Esta técnica fue ideada en 1989 por Kary B. Mullis que obtuvo el premio Nobel de Química en 1993 por dicho invento.

Para la PCR se utilizan dos oligonucleótidos sintéticos de unos 15-20 nucleótidos que son complementarios a las zonas flanqueantes de la región que se quiere amplificar. Estos oligonucleótidos (habitualmente conocidos por su nombre en inglés, "primers") actúan como cebadores para la síntesis in vitro de ADN la cual está habitualmente catalizada por una enzima llamada Taq polimerasa. Dicha enzima se aísla de una bacteria termófila, denominada Thermus Aquáticus, que es capaz de crecer a temperaturas elevadas (79 - 85 º C). A esta temperatura dicha enzima es capaz de mantener una media de extensión de más de 60 nucleótidos por segundo en regiones ricas en uniones G-C. La temperatura optima a la que actúa la Taq polimerasa permite el uso de elevadas temperaturas para la unión de los primers y para la extensión, de esta manera se aumenta el nivel de exigencia de la reacción y se reduce la extensión de los primers unidos inespecíficamente al ADN.

La reacción se lleva a cabo en una serie de  ciclos cada uno de los cuales incluye tres fases o pasos:

1. DESNATURALIZACIÓN:  Para que comience la reacción es necesario que el ADN molde se encuentre en forma de cadena sencilla. Esto se consigue aplicando temperaturas de 90 a 95ºC que producen la rotura de los puentes de hidrógeno intercatenarios y por lo tanto la separación de ambas cadenas. Para conseguir la completa separación de las hebras de toda la muestra esta temperatura debe mantenerse unos minutos. Si el ADN solo se desnaturaliza parcialmente éste tenderá a renaturalizarse rápidamente, evitando así una eficiente hibridación de los primers y una posterior extensión.
2. HIBRIDACIÓN:  Esta fase se denomina también fase de “annealing” o de emparejamiento. Una vez que el ADN está desnaturalizado se disminuye la temperatura hasta un rango comprendido entre los 40 y los 60ºC para que se pueda producir la unión de los primers a las secuencias flanqueantes del fragmento que se va a amplificar. La temperatura de fusión o annealing (Tm, “melting temperature”) depende de varios factores y es relativamente específica para cada primer. La longitud de los primers y la secuencia son críticas en la designación de los parámetros de una amplificación, una fórmula simple para calcular la Tm es la siguiente: 

Tm = 4(G+C) + 2 (A+T).

No obstante, cada primer exige una serie de estudios experimentales para determinar su temperatura de annealing específica ya que si la temperatura es muy baja la unión se hará de forma inespecífica y si es muy alta no se producirá una unión completa.

3. EXTENSIÓN:  Durante este paso la Taq polimerasa incorpora nucleótidos en el extremo 3' del primer utilizando como molde la cadena de ADN previamente desnaturalizada. La temperatura a la que se lleva a cabo este paso suele ser de 72ºC ya que es la temperatura a la que la Taq polimerasa alcanza su máxima actividad. Normalmente una extensión de 20 segundos es suficiente para fragmentos menores de   500 pb, y 40 segundos para fragmentos por encima de 1.2Kb.

Un factor importante en el transcurso de las diferentes fases es el tiempo de rampa. Este se define como el tiempo invertido en pasar de una temperatura a otra y depende del diseño y de las características del aparato donde se realiza automáticamente este proceso, el termociclador. En las nuevas generaciones de termocicladores este factor se ha ido optimizando para hacerlo mínimo.

2.2  Componentes de la PCR

2.2.1  BUFFER DE AMPLIFICACIÓN

Los buffer de PCR que se utilizan normalmente contienen KCl, Tris y MgCl_2.  El MgCl₂ es el componente que más influye en la especificidad y rendimiento de la reacción ya que los iones Mg²⁺ son necesarios para la actividad de la Taq polimerasa, es decir, actúan como cofactores de la polimerasa. 

La concentración óptima de MgCl₂ está en torno a 1.5 mM si se emplean concentraciones de 200 mM de cada uno de los dNTPs. No obstante, a veces es necesario probar con diferentes cantidades de Mg ya que un exceso del mismo origina una acumulación de productos inespecíficos y una cantidad insuficiente hace que disminuya el rendimiento de la amplificación.

2.2.2  PRIMERS

A la hora de elegir unos primers para amplificar un determinado fragmento de ADN hay una serie de reglas a seguir:

	La longitud de cada uno de los primers debe estar comprendida entre 18 y 24 bases ya que se ha comprobado que primers de mayor longitud (30-35 bases) no aumentan el rendimiento y los primers cortos carecen de suficiente especificidad.
	Ambos primers deben tener una Tm similar (como mucho la diferencia entre ambas temperatura debe ser de 5ºC).
	La relación bases púricas: bases pirimidínicas debe ser 1:1 (o como mucho 40-60%).
	La secuencia de los primers debe comenzar y terminar con 1-2 bases púricas.
	Para evitar la formación de dímeros de primers es necesario comprobar que  los primers no contengan secuencias complementarias entre sí.

Los dímeros de primers consisten en fragmentos de doble cadena cuya longitud es muy próxima a la de la suma de los primers y se producen cuando un primer es extendido a continuación del otro. El mecanismo exacto por el que se forman estos dímeros no está completamente determinado. La observación de que primers con los extremos 3' complementarios favorecen su formación sugiere que el paso inicial se debe a interacciones transitorias que aproximan los extremos complementarios. Algunas polimerasas, incluida la Taq, han mostrado una débil actividad polimerizadora no dirigida por un ADN patrón, la cual puede unir nucleótidos adicionales al doble extremo apareado. Si esta actividad puede producirse sobre una hebra sencilla de oligonucleótidos, resultaría una buena oportunidad para que la extensión formara un corto solapamiento en el extremo 3' con el otro primer, suficiente para promover la formación del dímero.

2.2.3  DESOXINUCLEÓTIDOS TRIFOSFATOS

Las concentraciones de dNTPs que suelen usarse están en torno a 200 µM para cada uno de ellos. En un volumen de reacción de 25 µl con esta concentración de dNTPs se sintetizarían entre 6-6.5 µg de ADN. La concentración de dNTPs y de MgCl₂ va relacionadas ya que el Mg se une a los dNTPs con lo que concentraciones elevadas de dNTPs inhibirían la reacción al no tener la Taq polimerasa suficiente Mg como para incorporar dNTPs. Para una concentración de 200 µM de cada dNTP se suele añadir MgCl₂ a una concentración de 1.5 mM.

2.2.4  TAQ-POLIMERASA

Las cantidades óptimas de Taq polimerasa necesarias para la síntesis de ADN están alrededor de 2 unidades en 25 µl de volumen final de reacción. La actividad de este enzima se ve influenciada por la concentración de dNTPs, de Mg²⁺ y de algunos iones monovalentes de manera que concentraciones elevadas de los mismos inhiben dicha actividad.

Por otro lado, pequeñas concentraciones de KCl estimulan la actividad sintética de la Taq en un 50-60% con un máximo aparente cuando su concentración es de 50 mM. Existen algunos datos relacionados con la influencia de ciertos reactivos que se emplean antes de la amplificación y que alteran la actividad de la Taq. Por ejemplo concentraciones 1M de urea estimulan la actividad, el SDS a bajas concentraciones que la inhibe al igual que concentraciones mayores del 10% de etanol. 

2.2.5  ADN MOLDE O “TEMPLATE"

Es el ADN del cual queremos copiar un determinado fragmento, es, por tanto, el ADN que la Taq polimerasa utiliza como molde para la síntesis de nuevas cadenas polinucleotídicas. La cantidad de ADN necesaria para la PCR depende de varios factores:

Del marcador que se va a amplificar: hay marcadores cuyos primers son más específicos o bien cuyas condiciones de amplificación están mejor optimizadas que las de otros. Por esta razón puede darse el caso de que cierta cantidad de ADN (sobre todo cuando jugamos con cantidades mínimas) amplifique para unos marcadores pero no para otros. Por ello, cuando en un laboratorio se va a utilizar un nuevo marcador es necesario hacer un estudio de validación en él que se incluye un estudio de sensibilidad. De dicho estudio de sensibilidad puede sacarse como conclusión cuál es la mínima cantidad de ADN que amplifica en condiciones estándar. De manera general, para casi todos los STR utilizados en Genética Forense la cantidad óptima de ADN que asegura un rendimiento adecuado está en torno a los 5 ng.

Calidad del ADN: Cuando se trabaja con ADN cuya calidad es óptima no suele haber problemas en la amplificación y cantidades del mismo por encima e incluso por debajo de los 5 ng rinden buenos resultados. El problema aparece cuando la calidad del ADN obtenido no es la idónea, bien porque esté degradado o bien porque dicho ADN vaya ligado a una serie de contaminantes que pueden inhibir la actividad de la polimerasa. Si el ADN está degradado por la acción de enzimas de restricción el que obtengamos o no resultado en la amplificación va a depender de que el fragmento a amplificar haya sido dañado o no. En el caso en el que tengamos ADN sin degradar pero unido a una serie de contaminantes habría que intentar diluir al máximo la muestra para disminuir dichos contaminantes, pero siempre dentro de un rango de ADN que no esté por debajo del límite de sensibilidad de la PCR. El problema de las cantidades mínimas de ADN y la presencia de contaminantes o inhibidores de la Taq es un hecho habitual en Criminalística y requiere un estudio pormenorizado de la muestra antes de la amplificación.

B. RFLP:

El análisis consiste en hacer un Southern Blotting (o "Southern blot" que es un método de biología molecular que sirve para verificar si una determinada secuencia de ADN está o no presente en una muestra de ADN analizada) y usar sondas específicas para detectar los VNTR (repeticiones en tandem de número variable).

En primer lugar el ADN que se va a analizar se separa de otros materiales. A continuación, debe cortarse en piezas de diferentes tamaños usando enzimas de restricción, que son proteínas que cortan el ADN sin dañar las bases. las piezas son clasificadas por tamaño mediante electroforesis en gel. Las piezas con carga positiva se van a la parte superior. El ADN que tiene una ligera carga negativa natural es atraído hacia el fondo. Las piezas más pequeñas se mueven más rápidamente a través del gel, por lo que será aún más hacia la parte inferior de las piezas grandes. Al separar las piezas por tamaño, los más altos se mantienen arriba y los más pequeños debajo. Luego por calor o solución alcalina, se aplica gel con el fin de desnaturalizar el ADN y se separa en fragmentos individuales. Una vez realizado esto el ADN esta ahora listo para ser analizados utilizando una sonda radiactiva de reacción de hibridación.

Para hacer la sonda radiactiva, se necesita la polimerasa del ADN. El ADN que se va someter a la radiactividad se coloca en un tubo de ensayo. A continuación se agrega la polimerasa en el tubo. Se disuelve y se espera a que comience a funcionar. Como los parches de polimerasa de ADN rompen el ADN, los actuales son sustituidos por los nuevos nucleotidos en el tubo. Cada vez que la muestra tenga una base Guanina, la Citosina será puesto en radiactividad. En la repetición del ADN, la polimerasa también se vuelve radioactiva. Las piezas radioactivas están listas para su utilización. Ahora la sonda radioactiva puede ser usada para crear una reacción de hibridación. La hibridación sucede cuando dos secuencias genéticas se unen a causa del hidrógeno que se encuentra en los pares de las bases. Hay dos de estos entre Adenina o Timina y tres de Citosina o Guanina. Para realizar la hibridación el ADN tiene que estar desnaturalizado.

El ADN desnaturalizado radioactivo y la sonda deber ser puestos en una bolsa de plástico con líquido salino y sellado fuertemente. La sonda se adherirá a la desnaturalización de ADN dondequiera que se encuentre de forma apropiada. La sonda y el ADN no tienen que encajar de forma exacta. Este proceso termina haciendo un patrón de ADN de las huellas digitales. Toda persona tiene un VNTRs que ha heredado de uno de sus padres y los VNTRs son únicos para cada persona.

C. AMP FLP:

Se trata de una técnica de amplificación de regiones polimórficas (con muchos polimorfismos [6]), preferiblemente el lócus D1S80. Este análisis pueden ser automatizado, y permite la fácil creación de árboles filogenéticos basados en la comparación de las muestras individuales de ADN.

Basado en el número variable de repetición en el tandem (VTNR) para distinguir diversos polimorfismos alelos, que son separados en un gel de poliacrilamida utilizado en una escalera alelica (en oposición a un peso molecular). Bandas podrían ser visualizados por tincíon de gel de plata. Un lugar popular para la toma de huellas dactilares es el locus D1S80. Al igual que los métodos basados en PCR, el ADN degradado o en cantidades muy pequeñas de ADN puede causar alélica de abandono.

Debido a su costo relativamente bajo y la facilidad para su puesta en marcha y operación, AmpFLP sigue siendo popular en los países de bajos ingresos.

D. STR:

Consiste en la amplificación de secuencias con pequeñas repeticiones en tandem que no se conservan dentro de la especie. Una vez amplificadas se separan los fragmentos para comprobar el número de repeticiones (mediante electroforesis capilar o en gel), de forma que se pueden distinguir patrones de repeticiones que pueden ser comparables y asociables.

Este método usa regiones altamente polimórficas que tienen secuencias cortas repetidas de ADN (el más común es de 4 bases repetidas, pero hay otras longitudes en uso, incluyendo bases 3 y 5). Porque diferentes personas tienen diferentes números de unidades de repetición y estas regiones de la DNA se puede utilizar para diferenciar entre las personas. Estos STR loci (lugares) son atacados con primers específicos de secuencia y se amplifican mediante PCR. Los fragmentos de ADN que son resultado entonces detectados y separados mediante electroforesis. Existen dos métodos de separación y detección, la electroforesis capilar (CE) y la electroforesis en gel.

Los polimorfismos STR mostrados en cada región son de por sí muy comunes, por lo general, cada polimorfismo es compartida por alrededor de un 5 - 20% de las personas. Cuando observamos múltiples loci, es la única combinación de estos polimorfismos de un individuo que hace que este método de discriminación sea un instrumento de identificación. Las regiones STR que se ponen a prueba en una persona se convierten en una discriminación de la prueba.

De un país a otro existen diferentes sistemas STR en el análisis de ADN que están en uso. En América del Norte los sistemas que amplifican el CODIS 13 loci núcleo son casi universal, mientras que en el Reino Unido, el sistema de SGM +, que es compatible con la base de datos nacional de ADN esta en uso. Cualquiera que sea el sistema utilizado, muchas de las regiones STR usadas en la prueba son los mismas. Estos sistemas de análisis de ADN se basan en torno a las reacciones múltiplex, el cual muchas regiones STR será sometido a prueba en el mismo tiempo.

La Electroforesis capilar (movimiento mediante la aplicación de un campo eléctrico), permite la inyección de fragmentos de ADN en un tubo de vidrio delgado (capilar) llena de polímeros. El ADN es extraído a través del tubo por la aplicación de un campo eléctrico, la separación de los fragmentos ocurre de tal manera que los más pequeños fragmentos de viajan más rápido a través de los capilares. Los fragmentos son entonces detectados utilizando colorantes fluorescentes que se adjunta a los primers utilizados en la PCR. Esto permite que múltiples fragmentos amplificados se ejecuten de manera simultánea, algo conocido como multiplexación. Luego se asignan tallas utilizando el tamaño del ADN como normas de etiquetado que se añaden a cada muestra, y el número de repeticiones se determinan comparando el tamaño de la escalera alélica, que contiene una muestra de todos los tamaños comunes de las posible repeticiones. Aunque este método es costoso, con mayor capacidad de las máquinas y un mayor rendimiento de las que se están utilizando para reducir el costo/muestra es posible reducir los retrasos que existen en muchas instalaciones de la delincuencia gobierno.

Electroforesis en gel es uno de los actos que es utilizado usando principios similares conocidos como "CE", pero en lugar de utilizar un capilar, el gran gel de poliacrilamida se utiliza para separar los fragmentos de ADN. Un campo eléctrico es aplicado, como en la CE, pero en lugar de correr todas las muestras por un detector, los fragmentos más pequeños se ejecutan cerca de la parte inferior del gel y todo el gel es escaneado y guardado en un ordenador. Esto produce una imagen que muestra todos los de las bandas correspondientes a diferentes tamaños y repite la escalera alélica. Este método no requiere el uso de las normas de tamaño, ya que la escalera alélica se ejecuta junto con las muestras y sirve para este propósito. La visualización puede ser a través de la utilización de marcados tintes fluorescentes primers en la tinción de plata o por el gel antes de escanear. A pesar de que es rentable y puede ser de bastante alto rendimiento, para aplicar la tinción de plata ITS se suspende. Además, muchos laboratorios están eliminación gradualmente geles a favor de la CE, haciendo el costo de las máquinas se haga más manejable.

El verdadero poder del análisis STR se encuentra en el poder estadístico de la discriminación. En los EE.UU., hay 13 centrales loci (lugares de ADN) que se utilizan actualmente para la discriminación en el CODIS. Debido a que estos lugares usan una variedad de forma independiente (con un determinado número de repeticiones en un locus no cambia la probabilidad de tener cualquier número de repeticiones en cualquier otro lugar), el producto de la regla de probabilidades se pueden aplicar. Esto significa que si alguien tiene el ADN de tipo ABC, en el que los tres loci son independientes, podemos decir que la probabilidad de que ese tipo de ADN es la probabilidad de tener tipo A veces la probabilidad de tener el tipo B veces es la probabilidad de tener el tipo de C. El método de mayor prevalencia de ADN de las huellas dactilares utilizados en la actualidad está basado en la PCR y utiliza corto repite tándem (STR). Este método usa regiones altamente polimórficas que han repetido secuencias cortas de ADN (el más común es de 4 bases repetidas, pero hay otras longitudes en uso, incluyendo bases 3 y 5). Porque diferentes personas tienen diferentes números de unidades de repetición, estas regiones de la DNA se puede utilizar para discriminar entre las personas. Estos STR loci (lugares) son atacados con primers específicos de secuencia y se amplifican mediante PCR. Los fragmentos de ADN que son resultado entonces detectados y separados mediante electroforesis. Existen dos métodos de separación y detección, la electroforesis capilar (CE) y la electroforesis en gel.

Los polimorfismos STR mostradas en cada región son de por sí muy común, por lo general, cada polimorfismo será compartido por alrededor de un 5 - 20% de las personas. Cuando observamos múltiples loci, la única combinaciones de estos polimorfismos de un individuo hace que este método de la discriminación sea un instrumento de identificación. Las demás regiones STR que se ponen a prueba en una persona se convierten en una discriminación de la prueba.

E. MITOCONDRIAL:

Se usa en muestras muy degradadas, ya que el DNA mitocondrial posee más copias que el nuclear. Se amplifican las regiones HV1(región en el ADN mitocondrial) y HV2 y se comparan siempre con familiares por parte materna ya que las mitocondrias son herencia ex