TEMA 8: MODIFICACIÓN GENÉTICA:

Biotecnología es un término muy amplio que en su definición admite asociarlo a cualquier técnica que utiliza organismos vivos para crear nuevos productos, para mejorar los rendimientos de plantas o animales, o para desarrollar microbios con fines específicos. Su definición incluye los métodos tradicionales de cultivo de plantas, ganadería y procesos de fermentación conocidos desde la antigüedad. Y a la vez también recoge métodos de la biotecnología moderna, como el uso industrial del ADN recombinante (ácido desoxiribonucleico), la fusión de células o las nuevas técnicas de bioprocesado.

Una parte importante de la biotecnología moderna es la interpretración, intercambio y modicación de los genes, las unidades responsables de la heredabilidad de los caracteres, como son el rendimiento de un cultivo, el color de una fruta o los enzimas producidos por un tipo de levadura.

La información que contienen los genes puede ser transferida entre distintas especies de animals, plantas o bacterias para obtener algunos resultados específicos. Por ejemplo, los genes de una proteína de origen bacteriano que es capaz de eliminar una plaga de un determinado insecto ha sido introducido con éxito en una serie de cultivos, reduciendo la necesidad de usar insecticidas químicos. Además de poderse tranferir genes de una especie a otra, también es posible ‘inactivar’ secuencias indeseadas. Por ejemplo esta técnica ha sido empleada para inactivar el gen responsable del reblandecimiento del tomate, obteniendo así un producto mucho más duradero.

Un organismo modificado genéticamente (abreviado OMG, OGM o GMO, este último del inglés Genetically Modified Organism) es aquel cuyo material genético es manipulado en laboratorios donde ha sido diseñado o alterado deliberadamente con el fin de otorgarle alguna característica específica. Comúnmente se los denomina transgénicos y son creados artificialmente en laboratorios por ingenieros genéticos.

Las técnicas de ingeniería genética que se usan consisten en aislar segmentos del ADN (material genético) para introducirlos en elgenoma (material hereditario) de otro, ya sea utilizando como vector otro ser vivo capaz de inocular fragmentos de ADN (Agrobacterium tumefaciens, una bacteria), ya sea bombardeando las células con micropartículas recubiertas del ADN que se pretenda introducir, u otros métodos físicos como descargas eléctricas que permitan penetrar los fragmentos de ADN hasta el interior del núcleo, a través de las membranas celulares.

Al ser la manipulación en el material genético, este es hereditario, puede transferirse a la siguiente generación salvo que la modificación esterilice al organismo transgénico.

¿Qué son los genes y dónde se encuentran?
Existen genes en todo aquello que está vivo, o que estuvo vivo. Existen genes en las personas, las moscas, el jamón, el tomate, las bacterias etc. Un filete de 200 g contiene 750.000.000.000.000 genes.
Un gen es un código que rige nuestro aspecto físico y nuestras características. Existen, por ejemplo, genes que deciden si vamos a tener los ojos azules o castaños. La mitad de nuestros genes son heredados de la madre y la otra mitad del padre.
Las plantas también tienen genes. Éstos deciden el color de las flores y la altura que una planta podrá alcanzar. Como en las personas, las características de una planta serán transferidas a sus "hijos": las semillas que crecen y se transforman en nuevas plantas.
¿Qué es la modificación genética?
La modificación genética altera los genes y, consecuentemente, las características del individuo. Es posible, por ejemplo, modificar genéticamente fresas para que se mantengan frescas durante más tiempo, y el arroz puede ser modificado genéticamente de forma que contenga un mayor valor vitamínico.
Cuando un científico modifica genéticamente una planta, introduce un gen extraño en los genes de la propia planta. Puede ser, por ejemplo, un gen de una bacteria resistente al pesticida. Como resultado, la planta modificada genéticamente hereda las características contenidas en el código genético, y se hace apta también para soportar los pesticidas.
Con la modificación genética, es posible transferir genes de una especie a otra. Esto es así porque todos los genes, tanto humanos como vegetales, animales o bacterianos son creados a partir del mismo material. Los científicos genéticos disponen así de una enorme cantidad de características genéticas donde elegir.
¿Cómo trabaja un científico genetista?La modificación genética de las plantas ocurre en varias fases:

1.	El científico encuentra y aisla el gen con las características genéticas deseadas. Este proceso se denomina cartografía.
2.	Se hacen varias copias del gen aislado. El proceso de copia se denomina PCR.
3.	Se transfieren los genes deseados a los genes de las propias plantas (utilizando un pedazo de tejido de la planta). Para introducir los genes deseados en la planta, el científico tiene tres opciones. Puede utilizar un "cañón de genes", una bacteria del suelo o un material llamado protoplasto. Los métodos de inserción de genes se llaman transformación.
4.	Se crea una nueva planta a partir del tejido de la planta modificada genéticamente.
5.	Se verifica si los genes insertados funcionan conforme a lo esperado.
6.	Se verifica también si el gen introducido aparece en las semillas de la planta.

¿Cómo sabemos si la modificación genética fue correcta?Raramente se puede ver a simple vista si una planta o un animal ha sido modificado genéticamente. Los científicos desarrollan, para esto, algunas técnicas útiles que les sirvan de ayuda.
Por ejemplo, existe un test de coloración especial que permite identificar si una planta está modificada genéticamente. Cuando la planta está modificada genéticamente, el científico inserta un "gen marcador" suplementario en la planta. El gen marcador puede tener diversas características; por ejemplo, el cambio de color de la planta cuando se expone a un test químico.
De este modo, los científicos pueden identificar si la planta fue o no genéticamente modificada efectuando un test químico y verificando el color de la planta.
¿Cuál es la diferencia entre la modificación genética y el procedimiento tradicional?Mucho antes de descubrir la modificación genética, los agricultores ya mejoraban sus cultivos a través de aquello que llamamos hoy "procedimiento tradicional".
El procedimiento es el cruce de los ejemplares mejores, mayores, más bonitos o más sabrosos de una cierta especie unos con otros de forma que se obtenga una planta o un animal aún mejor, mayor, más bonito o más sabroso.
En el procedimiento tradicional, los genes se transfieren de una planta a otra. Este es también el caso de la modificación genética, pero el modo de hacerlo es muy diferente.
La modificación genética es una técnica más precisa, en la que se puede ser exacto en la transferencia de las características deseadas. En el procedimiento tradicional, no es posible evitar la eventualidad de transferencia de otras características.
En el procedimiento tradicional, las características sólo pueden ser permutadas entre especies idénticas o muy semejantes. En la modificación genética, las características pueden ser transferidas de una especie a otra muy diferente, y lo mismo ocurre entre plantas y animales.
La modificación genética se produce más rápidamente que el procedimiento tradicional.
¿De qué otras formas pueden ser alterados los genes?
No sólo se utiliza la modificación genética para alterar los genes de plantas y animales.
Las alteraciones espontáneas, la radiación, los productos químicos y el procedimiento tradicional también pueden alterar las características de una planta o animal.
La alteración espontánea de genes ocurre naturalmente, y a veces sin ninguna eficacia. Una alteración espontánea puede llevar al desarrollo de características positivas y negativas. El método no es muy adecuado si la intención es crear alteraciones específicas.
La radiación y los químicos pueden ser utilizados para efectuar la alteración genética. Ambos elementos se utilizan en el procesamiento de plantas.
En el procedimiento tradicional se cruzan plantas y animales muy idénticos. Podrá ser el maíz y el nabo redondo o un caballo y un burro. De este modo, ocurren diversas combinaciones de genes en la progenitura. Los especímenes con características deseables son seleccionados a lo largo de varias generaciones. Los cultivos y el ganado que vemos hoy son el resultado del procedimiento tradicional.
¿Todo puede ser modificado genéticamente?
Sí. En principio cualquier cosa viva puede ser modificada genéticamente: animales, personas, plantas y bacterias.
En otras palabras, es posible transferir características de un pez a una fresa. Pero cuanto más diferentes sean las especies, más difícil es. Lo más fácil es modificar genéticamente las especies más semejantes.
No todas las características pueden ser transferidas. Algunas características ocurren sólo por la interacción entre gran cantidad de genes. Muy raramente los científicos tienen una perspectiva suficientemente buena de esta interacción para poderla recrear.
Actualmente, los científicos trabajan intensamente en la cartografía de genes en los humanos y en los cerdos. Tal vez esto les proporcione conocimientos y perspectivas suficientes para que en el futuro puedan crear modificaciones genéticas aún más complejas que las actuales.

TEMA 7: TÉCNICAS DE ANÁLISIS DE ADN:

A. PCR (REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA:

La reacción en cadena de la polimerasa (conocida como PCR por sus siglas en inglés, Polymerase Chain Reaction) permite amplificar más de un millón de veces un ADN obtenido a partir de una región seleccionada del genoma, siempre y cuando se conozca una parte de su secuencia de nucleótidos. Esta técnica fue ideada en 1989 por Kary B. Mullis que obtuvo el premio Nobel de Química en 1993 por dicho invento.

Para la PCR se utilizan dos oligonucleótidos sintéticos de unos 15-20 nucleótidos que son complementarios a las zonas flanqueantes de la región que se quiere amplificar. Estos oligonucleótidos (habitualmente conocidos por su nombre en inglés, "primers") actúan como cebadores para la síntesis in vitro de ADN la cual está habitualmente catalizada por una enzima llamada Taq polimerasa. Dicha enzima se aísla de una bacteria termófila, denominada Thermus Aquáticus, que es capaz de crecer a temperaturas elevadas (79 - 85 º C). A esta temperatura dicha enzima es capaz de mantener una media de extensión de más de 60 nucleótidos por segundo en regiones ricas en uniones G-C. La temperatura optima a la que actúa la Taq polimerasa permite el uso de elevadas temperaturas para la unión de los primers y para la extensión, de esta manera se aumenta el nivel de exigencia de la reacción y se reduce la extensión de los primers unidos inespecíficamente al ADN.

La reacción se lleva a cabo en una serie de  ciclos cada uno de los cuales incluye tres fases o pasos:

1. DESNATURALIZACIÓN:  Para que comience la reacción es necesario que el ADN molde se encuentre en forma de cadena sencilla. Esto se consigue aplicando temperaturas de 90 a 95ºC que producen la rotura de los puentes de hidrógeno intercatenarios y por lo tanto la separación de ambas cadenas. Para conseguir la completa separación de las hebras de toda la muestra esta temperatura debe mantenerse unos minutos. Si el ADN solo se desnaturaliza parcialmente éste tenderá a renaturalizarse rápidamente, evitando así una eficiente hibridación de los primers y una posterior extensión.
2. HIBRIDACIÓN:  Esta fase se denomina también fase de “annealing” o de emparejamiento. Una vez que el ADN está desnaturalizado se disminuye la temperatura hasta un rango comprendido entre los 40 y los 60ºC para que se pueda producir la unión de los primers a las secuencias flanqueantes del fragmento que se va a amplificar. La temperatura de fusión o annealing (Tm, “melting temperature”) depende de varios factores y es relativamente específica para cada primer. La longitud de los primers y la secuencia son críticas en la designación de los parámetros de una amplificación, una fórmula simple para calcular la Tm es la siguiente: 

Tm = 4(G+C) + 2 (A+T).

No obstante, cada primer exige una serie de estudios experimentales para determinar su temperatura de annealing específica ya que si la temperatura es muy baja la unión se hará de forma inespecífica y si es muy alta no se producirá una unión completa.

3. EXTENSIÓN:  Durante este paso la Taq polimerasa incorpora nucleótidos en el extremo 3' del primer utilizando como molde la cadena de ADN previamente desnaturalizada. La temperatura a la que se lleva a cabo este paso suele ser de 72ºC ya que es la temperatura a la que la Taq polimerasa alcanza su máxima actividad. Normalmente una extensión de 20 segundos es suficiente para fragmentos menores de   500 pb, y 40 segundos para fragmentos por encima de 1.2Kb.

Un factor importante en el transcurso de las diferentes fases es el tiempo de rampa. Este se define como el tiempo invertido en pasar de una temperatura a otra y depende del diseño y de las características del aparato donde se realiza automáticamente este proceso, el termociclador. En las nuevas generaciones de termocicladores este factor se ha ido optimizando para hacerlo mínimo.

2.2  Componentes de la PCR

2.2.1  BUFFER DE AMPLIFICACIÓN

Los buffer de PCR que se utilizan normalmente contienen KCl, Tris y MgCl_2.  El MgCl₂ es el componente que más influye en la especificidad y rendimiento de la reacción ya que los iones Mg²⁺ son necesarios para la actividad de la Taq polimerasa, es decir, actúan como cofactores de la polimerasa. 

La concentración óptima de MgCl₂ está en torno a 1.5 mM si se emplean concentraciones de 200 mM de cada uno de los dNTPs. No obstante, a veces es necesario probar con diferentes cantidades de Mg ya que un exceso del mismo origina una acumulación de productos inespecíficos y una cantidad insuficiente hace que disminuya el rendimiento de la amplificación.

2.2.2  PRIMERS

A la hora de elegir unos primers para amplificar un determinado fragmento de ADN hay una serie de reglas a seguir:

	La longitud de cada uno de los primers debe estar comprendida entre 18 y 24 bases ya que se ha comprobado que primers de mayor longitud (30-35 bases) no aumentan el rendimiento y los primers cortos carecen de suficiente especificidad.
	Ambos primers deben tener una Tm similar (como mucho la diferencia entre ambas temperatura debe ser de 5ºC).
	La relación bases púricas: bases pirimidínicas debe ser 1:1 (o como mucho 40-60%).
	La secuencia de los primers debe comenzar y terminar con 1-2 bases púricas.
	Para evitar la formación de dímeros de primers es necesario comprobar que  los primers no contengan secuencias complementarias entre sí.

Los dímeros de primers consisten en fragmentos de doble cadena cuya longitud es muy próxima a la de la suma de los primers y se producen cuando un primer es extendido a continuación del otro. El mecanismo exacto por el que se forman estos dímeros no está completamente determinado. La observación de que primers con los extremos 3' complementarios favorecen su formación sugiere que el paso inicial se debe a interacciones transitorias que aproximan los extremos complementarios. Algunas polimerasas, incluida la Taq, han mostrado una débil actividad polimerizadora no dirigida por un ADN patrón, la cual puede unir nucleótidos adicionales al doble extremo apareado. Si esta actividad puede producirse sobre una hebra sencilla de oligonucleótidos, resultaría una buena oportunidad para que la extensión formara un corto solapamiento en el extremo 3' con el otro primer, suficiente para promover la formación del dímero.

2.2.3  DESOXINUCLEÓTIDOS TRIFOSFATOS

Las concentraciones de dNTPs que suelen usarse están en torno a 200 µM para cada uno de ellos. En un volumen de reacción de 25 µl con esta concentración de dNTPs se sintetizarían entre 6-6.5 µg de ADN. La concentración de dNTPs y de MgCl₂ va relacionadas ya que el Mg se une a los dNTPs con lo que concentraciones elevadas de dNTPs inhibirían la reacción al no tener la Taq polimerasa suficiente Mg como para incorporar dNTPs. Para una concentración de 200 µM de cada dNTP se suele añadir MgCl₂ a una concentración de 1.5 mM.

2.2.4  TAQ-POLIMERASA

Las cantidades óptimas de Taq polimerasa necesarias para la síntesis de ADN están alrededor de 2 unidades en 25 µl de volumen final de reacción. La actividad de este enzima se ve influenciada por la concentración de dNTPs, de Mg²⁺ y de algunos iones monovalentes de manera que concentraciones elevadas de los mismos inhiben dicha actividad.

Por otro lado, pequeñas concentraciones de KCl estimulan la actividad sintética de la Taq en un 50-60% con un máximo aparente cuando su concentración es de 50 mM. Existen algunos datos relacionados con la influencia de ciertos reactivos que se emplean antes de la amplificación y que alteran la actividad de la Taq. Por ejemplo concentraciones 1M de urea estimulan la actividad, el SDS a bajas concentraciones que la inhibe al igual que concentraciones mayores del 10% de etanol. 

2.2.5  ADN MOLDE O “TEMPLATE"

Es el ADN del cual queremos copiar un determinado fragmento, es, por tanto, el ADN que la Taq polimerasa utiliza como molde para la síntesis de nuevas cadenas polinucleotídicas. La cantidad de ADN necesaria para la PCR depende de varios factores:

Del marcador que se va a amplificar: hay marcadores cuyos primers son más específicos o bien cuyas condiciones de amplificación están mejor optimizadas que las de otros. Por esta razón puede darse el caso de que cierta cantidad de ADN (sobre todo cuando jugamos con cantidades mínimas) amplifique para unos marcadores pero no para otros. Por ello, cuando en un laboratorio se va a utilizar un nuevo marcador es necesario hacer un estudio de validación en él que se incluye un estudio de sensibilidad. De dicho estudio de sensibilidad puede sacarse como conclusión cuál es la mínima cantidad de ADN que amplifica en condiciones estándar. De manera general, para casi todos los STR utilizados en Genética Forense la cantidad óptima de ADN que asegura un rendimiento adecuado está en torno a los 5 ng.

Calidad del ADN: Cuando se trabaja con ADN cuya calidad es óptima no suele haber problemas en la amplificación y cantidades del mismo por encima e incluso por debajo de los 5 ng rinden buenos resultados. El problema aparece cuando la calidad del ADN obtenido no es la idónea, bien porque esté degradado o bien porque dicho ADN vaya ligado a una serie de contaminantes que pueden inhibir la actividad de la polimerasa. Si el ADN está degradado por la acción de enzimas de restricción el que obtengamos o no resultado en la amplificación va a depender de que el fragmento a amplificar haya sido dañado o no. En el caso en el que tengamos ADN sin degradar pero unido a una serie de contaminantes habría que intentar diluir al máximo la muestra para disminuir dichos contaminantes, pero siempre dentro de un rango de ADN que no esté por debajo del límite de sensibilidad de la PCR. El problema de las cantidades mínimas de ADN y la presencia de contaminantes o inhibidores de la Taq es un hecho habitual en Criminalística y requiere un estudio pormenorizado de la muestra antes de la amplificación.

B. RFLP:

El análisis consiste en hacer un Southern Blotting (o "Southern blot" que es un método de biología molecular que sirve para verificar si una determinada secuencia de ADN está o no presente en una muestra de ADN analizada) y usar sondas específicas para detectar los VNTR (repeticiones en tandem de número variable).

En primer lugar el ADN que se va a analizar se separa de otros materiales. A continuación, debe cortarse en piezas de diferentes tamaños usando enzimas de restricción, que son proteínas que cortan el ADN sin dañar las bases. las piezas son clasificadas por tamaño mediante electroforesis en gel. Las piezas con carga positiva se van a la parte superior. El ADN que tiene una ligera carga negativa natural es atraído hacia el fondo. Las piezas más pequeñas se mueven más rápidamente a través del gel, por lo que será aún más hacia la parte inferior de las piezas grandes. Al separar las piezas por tamaño, los más altos se mantienen arriba y los más pequeños debajo. Luego por calor o solución alcalina, se aplica gel con el fin de desnaturalizar el ADN y se separa en fragmentos individuales. Una vez realizado esto el ADN esta ahora listo para ser analizados utilizando una sonda radiactiva de reacción de hibridación.

Para hacer la sonda radiactiva, se necesita la polimerasa del ADN. El ADN que se va someter a la radiactividad se coloca en un tubo de ensayo. A continuación se agrega la polimerasa en el tubo. Se disuelve y se espera a que comience a funcionar. Como los parches de polimerasa de ADN rompen el ADN, los actuales son sustituidos por los nuevos nucleotidos en el tubo. Cada vez que la muestra tenga una base Guanina, la Citosina será puesto en radiactividad. En la repetición del ADN, la polimerasa también se vuelve radioactiva. Las piezas radioactivas están listas para su utilización. Ahora la sonda radioactiva puede ser usada para crear una reacción de hibridación. La hibridación sucede cuando dos secuencias genéticas se unen a causa del hidrógeno que se encuentra en los pares de las bases. Hay dos de estos entre Adenina o Timina y tres de Citosina o Guanina. Para realizar la hibridación el ADN tiene que estar desnaturalizado.

El ADN desnaturalizado radioactivo y la sonda deber ser puestos en una bolsa de plástico con líquido salino y sellado fuertemente. La sonda se adherirá a la desnaturalización de ADN dondequiera que se encuentre de forma apropiada. La sonda y el ADN no tienen que encajar de forma exacta. Este proceso termina haciendo un patrón de ADN de las huellas digitales. Toda persona tiene un VNTRs que ha heredado de uno de sus padres y los VNTRs son únicos para cada persona.

C. AMP FLP:

Se trata de una técnica de amplificación de regiones polimórficas (con muchos polimorfismos [6]), preferiblemente el lócus D1S80. Este análisis pueden ser automatizado, y permite la fácil creación de árboles filogenéticos basados en la comparación de las muestras individuales de ADN.

Basado en el número variable de repetición en el tandem (VTNR) para distinguir diversos polimorfismos alelos, que son separados en un gel de poliacrilamida utilizado en una escalera alelica (en oposición a un peso molecular). Bandas podrían ser visualizados por tincíon de gel de plata. Un lugar popular para la toma de huellas dactilares es el locus D1S80. Al igual que los métodos basados en PCR, el ADN degradado o en cantidades muy pequeñas de ADN puede causar alélica de abandono.

Debido a su costo relativamente bajo y la facilidad para su puesta en marcha y operación, AmpFLP sigue siendo popular en los países de bajos ingresos.

D. STR:

Consiste en la amplificación de secuencias con pequeñas repeticiones en tandem que no se conservan dentro de la especie. Una vez amplificadas se separan los fragmentos para comprobar el número de repeticiones (mediante electroforesis capilar o en gel), de forma que se pueden distinguir patrones de repeticiones que pueden ser comparables y asociables.

Este método usa regiones altamente polimórficas que tienen secuencias cortas repetidas de ADN (el más común es de 4 bases repetidas, pero hay otras longitudes en uso, incluyendo bases 3 y 5). Porque diferentes personas tienen diferentes números de unidades de repetición y estas regiones de la DNA se puede utilizar para diferenciar entre las personas. Estos STR loci (lugares) son atacados con primers específicos de secuencia y se amplifican mediante PCR. Los fragmentos de ADN que son resultado entonces detectados y separados mediante electroforesis. Existen dos métodos de separación y detección, la electroforesis capilar (CE) y la electroforesis en gel.

Los polimorfismos STR mostrados en cada región son de por sí muy comunes, por lo general, cada polimorfismo es compartida por alrededor de un 5 - 20% de las personas. Cuando observamos múltiples loci, es la única combinación de estos polimorfismos de un individuo que hace que este método de discriminación sea un instrumento de identificación. Las regiones STR que se ponen a prueba en una persona se convierten en una discriminación de la prueba.

De un país a otro existen diferentes sistemas STR en el análisis de ADN que están en uso. En América del Norte los sistemas que amplifican el CODIS 13 loci núcleo son casi universal, mientras que en el Reino Unido, el sistema de SGM +, que es compatible con la base de datos nacional de ADN esta en uso. Cualquiera que sea el sistema utilizado, muchas de las regiones STR usadas en la prueba son los mismas. Estos sistemas de análisis de ADN se basan en torno a las reacciones múltiplex, el cual muchas regiones STR será sometido a prueba en el mismo tiempo.

La Electroforesis capilar (movimiento mediante la aplicación de un campo eléctrico), permite la inyección de fragmentos de ADN en un tubo de vidrio delgado (capilar) llena de polímeros. El ADN es extraído a través del tubo por la aplicación de un campo eléctrico, la separación de los fragmentos ocurre de tal manera que los más pequeños fragmentos de viajan más rápido a través de los capilares. Los fragmentos son entonces detectados utilizando colorantes fluorescentes que se adjunta a los primers utilizados en la PCR. Esto permite que múltiples fragmentos amplificados se ejecuten de manera simultánea, algo conocido como multiplexación. Luego se asignan tallas utilizando el tamaño del ADN como normas de etiquetado que se añaden a cada muestra, y el número de repeticiones se determinan comparando el tamaño de la escalera alélica, que contiene una muestra de todos los tamaños comunes de las posible repeticiones. Aunque este método es costoso, con mayor capacidad de las máquinas y un mayor rendimiento de las que se están utilizando para reducir el costo/muestra es posible reducir los retrasos que existen en muchas instalaciones de la delincuencia gobierno.

Electroforesis en gel es uno de los actos que es utilizado usando principios similares conocidos como "CE", pero en lugar de utilizar un capilar, el gran gel de poliacrilamida se utiliza para separar los fragmentos de ADN. Un campo eléctrico es aplicado, como en la CE, pero en lugar de correr todas las muestras por un detector, los fragmentos más pequeños se ejecutan cerca de la parte inferior del gel y todo el gel es escaneado y guardado en un ordenador. Esto produce una imagen que muestra todos los de las bandas correspondientes a diferentes tamaños y repite la escalera alélica. Este método no requiere el uso de las normas de tamaño, ya que la escalera alélica se ejecuta junto con las muestras y sirve para este propósito. La visualización puede ser a través de la utilización de marcados tintes fluorescentes primers en la tinción de plata o por el gel antes de escanear. A pesar de que es rentable y puede ser de bastante alto rendimiento, para aplicar la tinción de plata ITS se suspende. Además, muchos laboratorios están eliminación gradualmente geles a favor de la CE, haciendo el costo de las máquinas se haga más manejable.

El verdadero poder del análisis STR se encuentra en el poder estadístico de la discriminación. En los EE.UU., hay 13 centrales loci (lugares de ADN) que se utilizan actualmente para la discriminación en el CODIS. Debido a que estos lugares usan una variedad de forma independiente (con un determinado número de repeticiones en un locus no cambia la probabilidad de tener cualquier número de repeticiones en cualquier otro lugar), el producto de la regla de probabilidades se pueden aplicar. Esto significa que si alguien tiene el ADN de tipo ABC, en el que los tres loci son independientes, podemos decir que la probabilidad de que ese tipo de ADN es la probabilidad de tener tipo A veces la probabilidad de tener el tipo B veces es la probabilidad de tener el tipo de C. El método de mayor prevalencia de ADN de las huellas dactilares utilizados en la actualidad está basado en la PCR y utiliza corto repite tándem (STR). Este método usa regiones altamente polimórficas que han repetido secuencias cortas de ADN (el más común es de 4 bases repetidas, pero hay otras longitudes en uso, incluyendo bases 3 y 5). Porque diferentes personas tienen diferentes números de unidades de repetición, estas regiones de la DNA se puede utilizar para discriminar entre las personas. Estos STR loci (lugares) son atacados con primers específicos de secuencia y se amplifican mediante PCR. Los fragmentos de ADN que son resultado entonces detectados y separados mediante electroforesis. Existen dos métodos de separación y detección, la electroforesis capilar (CE) y la electroforesis en gel.

Los polimorfismos STR mostradas en cada región son de por sí muy común, por lo general, cada polimorfismo será compartido por alrededor de un 5 - 20% de las personas. Cuando observamos múltiples loci, la única combinaciones de estos polimorfismos de un individuo hace que este método de la discriminación sea un instrumento de identificación. Las demás regiones STR que se ponen a prueba en una persona se convierten en una discriminación de la prueba.

E. MITOCONDRIAL:

Se usa en muestras muy degradadas, ya que el DNA mitocondrial posee más copias que el nuclear. Se amplifican las regiones HV1(región en el ADN mitocondrial) y HV2 y se comparan siempre con familiares por parte materna ya que las mitocondrias son herencia ex

PREGUNTA PROBLEMA:

1. ¿Son las muestras de sangre mejores que las bucales?

2. ¿Qué tan precisos son los resultados en las pruebas de ADN? ¿Qué quiere decir 100% exclusión de paternidad?

3. ¿Es necesario que la madre también se analice?

4. ¿Se puede hacer pruebas de paternidad prenatales?

5. ¿Se puede hacer una prueba de paternidad sin el consentimiento de la madre?

6. ¿Porque algunos resultados de índice combinado de paternidad dan 99.98% y otros 99.9999995%?, por ejemplo

Desarrollo:

1.    En primer lugar, todo depende del equipo que se posea. Si se cuenta con una buena tecnología y expertos, una muestra de sangre tiene tanta calidad como las muestras bucales. La diferencia reside más en la practicidad para obtener dichas muestras. Y con el mismo apoyo de la tecnología, se pueden conservar perfectamente muestras bucales, lo que en principio era una debilidad y al mismo tiempo diferencia en comparación con las muestras de sangre (susceptibilidad ante el deterioro y degradación microbiológica)

Una muestra de sangre requiere expertos y equipos científicos, así como de procedimientos más complejos, más cuidados, los pinchazos, etc... Una muestra bucal sólo requiere de cualquier persona y no necesita de sofisticados equipos científicos para poder sacarla, además de que no hay dolor ni procedimientos muy científicos y sofisticados que requieran de un gran cálculo y cuidado.

Pero no es mejor una que otra, pues el ADN es siempre el mismo en todo el cuerpo, por lo que el lugar de la muestra no afecta la calidad de dicha muestra. Es tan solo el aspecto de la practicidad el que marca una diferencia de obtención, mas no de calidad.

2.    Por así decirlo, las pruebas de paternidad son infalibles. En caso de que se haga una prueba de paternidad (inclusión), la fiabilidad puede llegar a ser de un 99,99%. Y si se hace una prueba de no paternidad (exclusión), la fiabilidad sería total, es decir, de un 100%. (de no paternidad-imposibilidad de ser el padre biológico) y un 0% (de paternidad). Ya hablando de pruebas entre hermanos y abuelos, se da una fiabilidad del 90% de inclusión y un 15% de exclusión.

Es de resaltar que entre más marcadores genéticos, menos será el margen de error del cálculo de paternidad en la prueba. Generalmente se usan más de 16 marcadores genéticos (segmento de ADN con ubicación física identificable y herencia rastreable, que incluso puede ser un gen).

3.    No necesariamente dada la casi total (por no decir total) fiabilidad de la prueba de paternidad. Las pruebas de maternidad (y eso mencionando que no hay seguridad absoluta sobre la maternidad de un niño) se hacen, más que para identificar, para aclarar dudad, y en casos ya muy específicos como: fertilizaciones in vitro, adopciones, inmigraciones, desapariciones o secuestros y/o identificaciones de recién nacidos.

Es exigencia en casos legales, pero contando con la disponibilidad de la madre. Ya en casos informativos, es opcional y sólo perfecciona el resultado, la probabilidad.

4.    Si, si se desea conocer la paternidad incluso durante la gestación. Claro que hay que tener en cuenta varios aspectos y factores, como el estado de gestación. Se pueden extraer células tanto de la placenta como del líquido amniótico que rodea al feto durante su desarrollo.

Pero esto conlleva un gran riesgo de embarazo, por lo que la decisión del ginecólogo y por supuesto de la madre son indispensables.

5.    Depende básicamente de la legislación de cada país y otros factores. En una corte se debe tener la validación y muestra de la madre (preferencialmente).

Y, como se dice, de poderse se puede. Un padre puede enviar muestras sin conocimiento de la madre. Pero es de resaltar que sería ilegal en caso de que no sea el padre legal del niño, además de que esto no podría usarse en una corte.

6.    Depende de la frecuencia en la aparición de los alelos y su exoticidad. Entre más raros o exóticos sean los alelos en común en el índice combinado, mayor será dicho índice. Pero si las coincidencias se presentan en alelos muy comunes, el índice no será tan alto.

En todo caso, incluso para lograr un índice combinado del 99.9999% se necesitarían unas coincidencias totales entre los alelos del padre y el hijo. 

TEMA 6: ANÁLISIS DE CARIOTIPO


Antes de comenzar con los análisis de los cariotipos, es menester identificar como se logran dichos cariotipos. Comenzando con que se extraen células de determinados tejidos. Puede ser cualquier célula, pero generalmente se extraen los cromosomas de: linfocitos, fibroblastos, médula ósea, piel y células fetales. 


Luego de extraer las células como tales(de la sangre puede ser), se emplea un anticoagulante y se cultivan las mismas células en un medio que combate las bacterias (con antibióticos). Se agrega mitógeno, para estimular la división celular (asimismo, la célula secreta interleuquinas). Se cultiva durante 72 horas a 37°C, para luego bloquear la mitosis en la metafase y así, mediante un choque hipotónico, separar los cromosomas, organizarlos y tomarles la fotografía (el famoso cariotipo).


Ahora con el cariotipo en mano, tenemos, en condiciones normales, 22 pares de cromosomas homólogos, llamados autosomas, y 1 par de cromosomas sexuales (XX para la mujer y XY para el hombre). Se encuentran también como características de análisis: los cromosomas sufren grandes variaciones en su tamaño a lo largo del ciclo celular, pasando de estar muy poco compactados (interfase) a estar muy compactados (metafase), diferencia de posición del centrómero, diferencias en el número básico de cromosomas que puede ocurrir debido a desplazamientos sucesivos que quitan todo el material genético de un cromosoma, haciendo que este se pierda, diferencias de grado y distribución de regiones de heterocromatina (forma inactiva de ADN condensada localizada sobre todo en la periferia del núcleo que se tiñe fuertemente con las coloraciones, tomando coloración más oscura que la cromatina).


Un análisis de cariotipos no pretende decir que dicho cariotipo es normal. La intención es detectar anomalías o mutaciones, no a nivel de los genes, o del ADN, pero si a nivel cromosómico.


Y ahí podemos encontrar anomalías de tipo numérico y estructural. Las anomalías numéricas son aquellas dadas por un número mayor o menor en el total de cromosomas, y se identifican mediante la señalación del cromosoma de mas o de menos en su respectivo par. Por ejemplo, será una trisomía si son tres cromosomas y no dos o será una monosomía si es un cromosoma y no dos. Las estructurales tienen que ver ya, más que todo, con que el cromosoma esté completo, con la información genética que contiene completa, y no se hayan recortado pedazos de cromosomas, etc...(translocaciones, inversiones a gran escala, supresiones o duplicaciones).


EJEMPLOS:


1. Síndrome X frágil: 
Es un trastorno que ocasiona retraso mental. Es la primera causa hereditaria de retraso mental y la segunda asociada a factores genéticos luego del síndrome de Down, siendo este último de origen congénito (no necesariamente heredado). Este trastorno ocasiona una clase de mutación poco habitual: una secuencia reiterada de tres letras del código del ADN, llamada repetición de triplete. Cuanto mayor sea el número de repeticiones, más alta será la probabilidad de que el afectado sufra mayores alteraciones patológicas. El SXF resulta, en particular, de un defecto en un gen llamado FMR1. El defecto en este gen es una repetición del trinucleótido CGGn (triplete Citosina-Guanina-Guanina), en una parte del mismo que regula su expresión. Cuando este grupo de tres nucleótidos se amplifica (se repite) más de 200 veces, se extingue la expresión del gen o, en otras palabras, se apaga el gen, produciéndose así lo que conocemos como síndrome del X frágil.

Las características físicas típicas del síndrome de X frágil incluye cara larga, orejas prominentes y testículos grandes (macroorquidismo). Sin embargo, a menudo los niños pequeños tienen esas características. La cara alargada y el macroorquidismo usualmente no son notables sino hasta la pubertad. Al menos 25-30% de los niños pequeños pueden no tener las características típicas faciales del síndrome de X frágil. Algunas veces estos niños son diagnosticados como afectados de otras enfermedades, tales como autismo, síndrome de Sotos (gigantismo cerebral), síndrome de Tourette, síndrome de Prader Willi o síndrome de Pierre Robin (también llamado complejo o secuencia de Pierre Robin). El fenotipo físico de los niños pequeños incluye usualmente hiperextensibilidad de los dedos, piel laxa, pie plano, presentando usualmente retardo en el lenguaje o síntomas de desatención. En todos los niños que presenten retraso mental o autismo de etiología desconocida debe ser descartado el síndrome de X frágil. También deberían ser estudiados los individuos con significativas deficiencias de aprendizaje, con características físicas o conductuales del síndrome de X frágil.

El fenotipo conductual del síndrome de X frágil incluye pobre contacto visual, rechazo al tacto, aleteo, mordisqueo de manos, y timidez o ansiedad social. Aproximadamente del 15 al 30% de los niños con X frágil tienen autismo y aproximadamente el 6% de los varones autistas tienen el síndrome de X frágil. Las niñas con X frágil usualmente presentan timidez, ansiedad social, dificultades con las matemáticas en la escuela, y problemas de atención.

Las rabietas son comunes en la niñez temprana. Los comportamientos explosivos o de agresión pueden ser un problema en la adolescencia para aproximadamente un 30%. Los cambios neuroanatómicos en el cerebro de individuos con el síndrome de X frágil incluyen un agrandamiento del núcleo caudado, del hipocampo, y ventrículos laterales. El vermis cerebeloso es más pequeño de lo normal. El tamaño del cerebelo está correlacionado con el nivel cognitivo, incluyendo la función ejecutiva.8 Ciertos diagnósticos psiquiátricos, incluyendo el Síndrome de Asperger, trastornos evitativos de la niñez, trastorno esquizoide de la personalidad y mutismo selectivo, también deben ser considerados para pruebas de ADN.

2. Síndrome de Klineferter:

Los seres humanos tienen 46 cromosomas. Los cromosomas contienen todos los genes y el ADN, los pilares fundamentales del cuerpo. Los dos cromosomas sexuales determinan si uno se convierte en niño o en niña. Las mujeres normalmente tienen dos de los mismos cromosomas sexuales, que se escriben como XX, mientras que los hombres normalmente tienen un cromosoma X y un cromosoma Y, que se escriben como XY.

El síndrome de Klinefelter es uno de un grupo de problemas de los cromosomas sexuales y ocurre en hombres que tienen al menos un cromosoma X extra. Por lo general, esto se presenta debido a un cromosoma X adicional (escrito como XXY).

El síndrome de Klinefelter se encuentra en aproximadamente uno de cada 500 a 1,000 varones recién nacidos. Las mujeres con embarazos después de los 35 años tienen una probabilidad ligeramente mayor de tener un niño con este síndrome que las mujeres más jóvenes.

El síntoma más común es la infertilidad. Otros síntomas pueden abarcar:

• Proporciones corporales anormales (piernas largas, tronco corto, hombro igual al tamaño de la cadera)
• Agrandamiento de las mamas (ginecomastia)
• Problemas sexuales
• Vello púbico, axilar y facial menor a la cantidad normal
• Testículos pequeños y firmes
• Estatura alta

3. Síndrome del supermacho o 47 XYY:

El síndrome del súper hombre (XYY) es una enfermedadcromosómica rara que afecta a varones. Está causado por unatrisomía sexual que produce la existencia de un cromosoma Y adicional.

Los cromosomas se encuentran en el núcleo de todas las células del cuerpo. Llevan las características genéticas de cada individuo.

Este síndrome no es heredable, pero usualmente ocurre como evento aleatorio durante la formación del espermatozoide. Un error en la división celular durante la metafase II de la meiosis, llamada no disyunción meiótica, puede dar como resultado un espermatozoide con una copia extra del cromosoma Y. Si uno de estos espermatozoides atípicos contribuye a la formación genética del niño, éste tendrá un cromosoma Y extra en cada célula de su cuerpo.
En algunos casos, la adición del cromosoma Y extra resulta de la no disyunción durante la división celular postcigótica (mitosis) en el desarrollo embrionario temprano.

Los individuos afectados son generalmente muy altos y delgados. La mayoría presenta un acné severo durante la adolescencia. Pueden asociar también problemas antisociales o del comportamiento o tener una inteligencia inferior a la media.

4. Síndrome de Edwards:

Es un trastorno genético en el cual una persona tiene una tercera copia del material genético del cromosoma18, en lugar de las dos copias normales.

La trisomía 18 es un síndrome relativamente común y es tres veces más frecuente en las niñas que en los niños. El síndrome es causado por la presencia de un material adicional del cromosoma 18, que interfiere con el desarrollo normal.

Debido a su alta tasa de mortalidad en los recién nacidos (por encima el 90% de los casos) se le ha considerado como una enfermedad de tipo “letal”. Las expectativas de vida de un recién nacido con trisomia completa del par 18 no supera el año.

Características o síntomas:

• Puños bien cerrados
• Piernas cruzadas (posición preferida)
• Pies con un fondo redondeado (pies en mecedora o pies convexos)
• Bajo peso al nacer
• Orejas de implantación baja
• Retardo mental
• Cabeza pequeña (microcefalia)
• Mandíbula pequeña (micrognacia)
• Uñas subdesarrolladas
• Criptorquidia
• Forma inusual del pecho (tórax en quilla)

5. Síndrome de superhembra:

Las niñas y mujeres que tienen el síndrome 47, XXX tienen tres cromosomas X en lugar de dos, que es lo normal. Este cambio de cromosomas se escribe "47, XXX". Esto significa que hay 47 cromosomas en lugar de 46, que es lo normal, y que hay tres cromosomas X en vez de dos. El cromosoma X extra se obtuvo durante la formación del esperma o del óvulo que más tarde se unieron para formar el feto, o durante el desarrollo temprano del feto poco después de la concepción. Este cromosoma extra no puede ser  removido nunca. El síndrome 47, XXX ocurre al azar. No hay nada que hicieron los padres para que sucediera, ni tampoco hay nada que pudieron hacer para evitarlo. Aproximadamente  una  de  cada  1000  a  1200 mujeres tienen el síndrome 47, XXX

El cambio en el cromosoma que causa el síndrome 47, XXX no puede ser reparado nunca. Sin embargo, la ayuda por parte de la familia y el personalescolar pueden reducir los problemas de aprendizaje y de comportamiento.

Las recién nacidas y las niñas con síndrome 47, XXX se parecen a otras niñas de su edad. Suelen ser más altas que el resto de las niñas en su familia y pueden tener menos coordinación. Las mujeres con síndrome 47, XXX usualmente son capaces de tener hijos (son fértiles). Los rasgos físicos en las personas con síndrome 47, XXX puede darse en niñas y mujeres con un número normal de cromosomas.

De todas las condiciones de cromosomas del sexo, el síndrome 47, XXX es uno de los que se asocian más con problemas mentales y de comportamiento. Una probabilidad alta de tener problemas en el lenguaje y el habla pueden causar retrasos en las habilidades sociales y de aprendizaje. Por consiguiente, estas niñas suelen necesitar ayuda adicional para tener éxito en la escuela.